乌丹降脂胶囊对NAFLD模型SD大鼠体内Treg细胞的影响

金鹏　杨莉　贾彦生　张志

乌丹降脂胶囊对NAFLD模型SD大鼠体内Treg细胞的影响

金鹏杨莉贾彦生张志

【摘要】目的探讨乌丹降脂胶囊对大鼠非酒精性脂肪肝(NASH)模型外周血中Treg细胞和相关细胞因子额含量，探讨乌丹降脂胶囊对Treg细胞的影响。方法40只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、易善复组、乌丹降脂胶囊组，正常对照组以基础饲料喂饲，其他三组连续16周通过高脂饲料喂饲，建立非酒精性脂肪肝病模型，同时正常对照组、模型对照组，以生理盐水10ml/(kg·d)灌胃;易善复组以易善复溶液灌胃10ml/(kg·d);乌丹降脂胶囊组以乌丹降脂胶囊灌胃10ml/(kg·d);连续灌胃14周后，检测全血Treg细胞的表达量及血清IL-6、IL-10 及TGF-β1的含量。结果与正常对照组相比，模型组Treg细胞的表达量及血清IL-6、IL-10及TGF-β1的含量均升高;与模型组相比，乌丹降脂胶囊组及易复善组Treg细胞的表达量及血清IL-6、IL-10及TGF-β1的含量均明显降低，且差异有统计学意义(P＜0.05)。结论乌丹降脂胶囊可能通过抑制炎症的发生使Treg细胞及其相关细胞因子表达量降低，从而对Treg细胞的功能紊乱进行调节。

【关键词】乌丹降脂胶囊; Treg细胞;血清IL-6; IL-10; TGF-β1;细胞因子

【中图分类号】R 975

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2433－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.009

收稿日期:(2015－02－13)

项目来源:河北省中医药管理局科学技术研究计划基金项目(编号:2012166);河北省科技厅科技计划项目(编号:14277753D)

作者单位: 050021河北省石家庄市第五医院

通讯作者:杨莉，050021河北省石家庄市第五医院;

E-mail: yangli_yl6666@126.com

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是临床中较为常见的肝病，有资料显示，随着人民生活水平的提高及实验室检查的普及，脂肪肝的发病率不断上升，非酒精性脂肪肝(NAFLD)在我国已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病［1］。NAFLD发生发展的分子机制尚不完全清楚，目前最成熟的假说是Day提出的“二次打击”学说［2］，但并不能圆满解释NAFLD的所有临床现象。近年来，越来越多的研究表明NAFLD的发生发展过程存在免疫微环境的变化，调节性T细胞(CD4+CD2+5regulatory Tcell，Treg)的异常可能是其病理机制之一，但是中药治疗脂肪肝时对Treg细胞的影响的研究较少见。乌丹降脂胶囊(冀药制字Z20051051)，是石家庄市第五医院自行研制的用于脂肪肝的治疗药物，经多年临床观察疗效显著。本研究通过大鼠非酒精性脂肪肝模型研究乌丹降脂胶囊在非酒精性脂肪肝形成中对Treg细胞及其相关细胞因子的影响，从免疫微环境方面探讨乌丹降脂胶囊治疗脂肪肝的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠40只，雄性，无特定病原体级(SPF)，体重(200±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号:1302094。

1.2饲料与药物基础饲料:由河北医科大学实验动物中心加工生产;高脂饲料配方:胆固醇2%，猪油10%，基础饲料88%;乌丹降脂胶囊:石家庄市第五医院临床治疗脂肪肝的经验方，由石家庄市第五医院制剂室提供，冀药制字: Z20051051;易善复由赛诺菲安万特公司生产，国药准字: HZ20109010。

1.3实验试剂及主要仪器检测血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的ELISA试剂盒由R＆D公司生产，主要检测仪器为芬兰Thermo公司产MK3型全自动酶标仪，所用流式抗体均购自Biolegend公司，FOXP3 FIX/ Prem Buffer Set、FOXP3＆PERM Kit(破膜剂)均购自Liankebio公司，流式细胞仪为BD公司的

1.4实验动物造模方法及标本留取40只SD大鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、易善复组和乌丹降脂胶囊组。正常对照组以基础饲料喂食，而模型对照组、易善复组和乌丹降脂胶囊组则以高脂饲料喂饲，连续喂养2周后，正常对照组、模型对照组以0.9%氯化钠溶液10ml·kg－1·d－1灌胃;易善复组以易善复溶液(将易善复用双蒸水配制成8.523 g/L的溶液)10ml·kg－1·d－1灌胃;乌丹降脂胶囊组以乌丹降脂胶囊溶液(将乌丹降脂胶囊用双蒸水配置成41.667 g/L的溶液)10ml·kg－1·d－1灌胃，连续灌胃14周。实验结束后，3%戊巴比妥钠(0.15ml/100 g)腹腔注射麻醉，无菌采集外周静脉血，凝固后2 000 r/min离心10min，分离血清备用，同

时保留1ml EDTA抗凝血备用。

1.5大鼠外周血Treg细胞表达量的检测取100 μl抗凝全血加至流式管中，分别加入抗体CD4-PE-CY7、CD25-FITC各5 μl，混匀，室温避光孵育15min加入PBS 1ml，1 500 r/m离心5min，弃上清;加入A液(破膜剂A)100 μl，室温避光孵育15min，1 500 r/m离心5min，弃上清;加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3ml，1 500 r/m离心5min;加入B液(破膜剂B)100 μl及Foxp3mAb-PE10～20 μl，混匀，室温孵育20min，加入Foxp3 Fix/Prem Buffe 3ml，1 500 r/m离心5min，弃上清;加入PBS 500 μl重悬细胞，上流式细胞仪检测(CD4+CD25+Foxp3+)Treg细胞表达量。

1.6血清IL-10、IL-6和TGF-β1的检测采用ELISA法测定血清中IL-10、IL-6和TGF-β1的含量，严格按说明书操作。

2　结果

2.1 Treg细胞表达量的检测与正常对照组相比，模型组，易善复组的Treg细胞表达量明显升高，差异有统计学意义(P = 0.001，0.004)，乌丹降脂胶囊组虽亦升高，但差异无统计学意义(P =0.779);与模型组相比，易善复组、乌丹降脂胶囊组的Treg细胞表达量均明显降低，乌丹降脂胶囊组降低的差异有统计学意义(P =0.096，0.001)。见表1及图1。

2.2 4组血清IL-6的含量与正常对照组相比，模型组，易善复组的血清中IL-6的含量均升高，乌丹降脂胶囊组则降低，但是4组之间差异不显著。见表1。

2.3 4组血清IL-10的含量与正常对照组相比，模型组血清IL-10的含量明显升高，差异具有显著性(P =0.046);与模型组相比，易善复组、乌丹降脂胶囊组血清IL-10的含量均明显降低，差异具有显著性(P = 0.041，0.006)。见表1。

2.4 4组血清TGF-β1的含量与正常对照组相比，模型组血清TGF-β1的含量明显升高，易善复组则明显降低，差异有统计学意义(P =0.001，0.047)，乌丹降脂胶囊组血清TGF-β1的含量亦降低，差异无统计学意义(P = 0.223);与模型组相比，易善复组、乌丹降脂胶囊组血清TGF-β1的含量均明显降低，差异有统计学意义(P =0.001，0.001)。见表1。

表1　4组大鼠外周血中Treg细胞表达量及细胞因子的含量

图1　(CD+4CD+25Foxp3+)Treg细胞流式细胞术检测示意图

3　讨论

根据NAFLD的临床表现，应属于中医学的“肝癖”、“胁痛掣、积聚”等范畴［3］。目前很多研究显示临床工作者将辨病与辨证相结合，遣方用药，有效地改善了非酒精性脂肪肝患者的肝功能、临床症状等，取得了满意的临床效果。虽然中医药在研究本病防治方面具有不可忽视的潜力，但是实验研究起步较晚，对中医药的疗效机制的研究较为欠缺。本研究中的乌丹降脂胶囊的生山楂可消食导滞，化痰消积，陈皮可以健脾燥湿化痰，半夏可以燥湿化痰，消痞散结，丹参可活血祛瘀的作用，从中医的角度来看具有健脾化痰、活血化瘀的功效，有利于脂肪肝的治疗。近年来免疫系统在NASH发病中的作用越来越受到重视，CD+4CD+25。

Treg是目前研究最多的一群调节性T细胞，它是一类具有免疫调节作用的细胞群，可通过细胞接触依赖机制或细胞因子(如IL-10或TGF-β等)机制发挥抑

制免疫T细胞活化、维持免疫耐受以及防止免疫性疾病发生的作用［4］。Foxp 3对于CD4+CD2+5Treg的生长发育和功能维持起着重要的作用，因此，CD4+CD2+5Foxp3+Treg细胞表达量的检测更能反应机体内Treg细胞的功能状态。本研究中与正常对照组相比，模型组的CD4+CD2+5Foxp3+Treg细胞表达量明显升高，这和程瑗［5］的临床研究一致，表明在NAFLD形成中，确实存在Treg细胞的功能紊乱，或许为了发挥保护机体避免更严重损伤，抑制过激的炎性反应的作用，Treg细胞不断增高，抑制T细胞的细胞毒作用，但这可能也同时造成了低度炎性反应状态的持续，并造成Th1/ Th2平衡紊乱。乌丹降脂胶囊组及易善复组的CD4+CD2+5Foxp3+Treg的表达量与模型组相比明显降低，尤其乌丹降脂胶囊组的表达量与正常对照组差异不大，由此可见乌丹降脂胶囊的使用可调节脂肪肝机体内Treg细胞的功能紊乱。

Treg通过分泌IL-4、IL-10和TGF-β，参与自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤免疫等［6］IL-10和TGF-β1为抗炎性细胞因子，在本研究中显示模型组IL-10和TGF-β1的含量比正常对照组明显升高，可见CD4+CD2+5Foxp3+Treg细胞通过这两种细胞因子来执行抑制炎症的功能，亦有人提出Treg可通过分泌转化生长因子(TGF-β)以及细胞直接接触，与作为抗原提呈细胞的各种免疫细胞(如肝脏局部的肝星状细胞)发挥直接作用，Treg亦有可能是促进肝脏纤维化甚至其他系统功能失代偿的“帮凶”［5］，表明Treg细胞分泌的TGF-β的升高也可能是促进脂肪肝形成肝纤维化机制之一。本研究显示乌丹降脂胶囊可以使大鼠体内这两种细胞因子的含量明显降低，甚至低于正常对照组，由此可见乌丹降脂胶囊组可以明显抑制Treg细胞促进肝纤维化形成的作用但是也同时降低了Treg细胞通过细胞因子发挥的免疫抑制功能。

Treg细胞主要是抑制免疫应答的作用，那么Treg细胞的减少，炎症反应会不会严重，IL-6是一种广泛表达具有多种功能的炎性因子。IL-6能抑制脂蛋白酶的活性，抑制脂肪分解，使脂肪储存增加，循环中TG水平升高，进而促进脂肪肝的形成［7］。在本研究中虽然四组体内IL-6的含量差异不显著，但是与正常对照组相比，模型组升高的较多，而乌丹降脂胶囊组则低于正常对照组，由此可见乌丹降脂胶囊对IL-6的产生起抑制作用，从而阻止脂肪肝的形成。由此可见乌丹降脂胶囊可以抑制肝脏炎症发生的作用，那么是否由于肝脏炎症减轻，使Treg细胞的表达量明显降低，亦阻止了Treg细胞促进脂肪肝形成肝纤维化的功能，这需要我们进一步研究。

总之，乌丹降脂胶囊可以调节Treg细胞的功能紊乱，且这方面功能明显强于易善复，中药的作用是多靶点的，可见调节Treg细胞的功能亦是乌丹降脂胶囊作用机制之一，只是它在抑制脂肪肝进展中的作用机制还需要我们进一步研究，为中药治疗NAFLD探索新的思路。

参考文献

1郑全喜，王昆，刘超.菲酒精性脂肪肝肝病动物模型的研究进展.中国实验方剂学杂志，2013，19:357.

2 Day CP，James O.Steatohepatitis: a tale of two“hits”? Gastroenterology，1998，114:842-845.

3乔娜丽，杨钦河，纪桂元，等.论肝郁脾虚是脂肪肝的基本发病病机.时珍国医国药，2008，19:1238-1239.

4 Wing K，Fehérvári Z，Sakaguchi S.Emerging possibilities in the development and function of regulatorytcells.Int Immunol，2006，18: 991-1000.

5程瑗，陈永平，金晓芝，等.非酒精性单纯性脂肪肝患者外周血CD4+CD25 +调节性T细胞数量变化及临床意义.中华传染病杂志，2012，30:43-47.

6 Wing K，Fehérvári Z，Sakaguchi S.Emerging possibilities in the development and function of regulatorytcells.Int Immunol，2006，18: 991-1000.

7陈静英，蓝显明，张雪芳，等.当归注射液治疗大鼠非酒精性脂肪肝的实验研究.北方药学，2014，11:77-78.