精原干细胞：生殖保护与再生医学的新来源

宁亮 张倩倩 杨林 吴大鹏 贺大林

精原干细胞：生殖保护与再生医学的新来源

宁亮 张倩倩 杨林 吴大鹏 贺大林

精原干细胞（SSC）是存在于睾丸生精小管，不断增殖和分化以产生精子的男性生殖干细胞。SSC的冻存和移植被认为是未成年肿瘤患儿生殖保护的重要手段。近年来研究报道表明人类和鼠类的SSC可以在体内和体外分化为具有多能性的细胞，这些在表现型和功能上都和胚胎干细胞有一定的相似性。因此，精原干细胞SSC也被认为是很有希望成为再生医学中基于干细胞治疗方面的新来源。

再生医学； 精原细胞； 干细胞移植； 细胞分化

不育症是指“婚后同居2年以上未采取避孕措施女方未怀孕”。不育症的发病率约为15%，其中男性因素约占50%。男性不育症是一种可由多种方面的障碍导致的多因素综合征，环境因素（如：放化疗，有性腺毒性的药物）和遗传因素（如Klinefelter's 综合征）可能影响精子的生成过程从而导致不育症的发生［1］。

生育能力的保存是一个新兴的领域，包涵了多种可以预防（治疗）面临生殖力损害危险患者的方法，然而，因为无法取得成熟的精子，这种方法不能用于儿童。因此，精原干细胞（spermatogonial stem cell，SSC）的保存与移植成为因放化疗致生殖干细胞丢失而导致生殖障碍的重要方法［2］。

一、SSC概念

（一）SSC的定义

胚胎早期，生殖细胞的形成来源于原始生殖细胞的分化。胚胎第4周或第5周时，上胚层逐渐迁移并置换下胚层形成内胚层，同时，在内胚层内出现原始生殖细胞，在第5 ～6周时，原始生殖细胞经肠背系膜迁移入生殖嵴，在迁移过程中，原始生殖细胞不断增殖，一旦到达生殖嵴就分化为精原细胞并进入有丝分裂阻滞期。出生后不久，精原细胞定位于生精小管基膜上重新启动有丝分裂过程，此后，被称为SSC。成年男性睾丸中仅有0.03%的生殖细胞是SSC，它们具有自我更新和多向分化从而产生精子的能力［3］。

（二）SSC的表面标志物

有很多不同的标记物可以用来分选鼠类SSC，如：阳性选择标记物：α6-整合素（CD49f）［4］、β1-整合素（CD29）［4］、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）家族受体α1（GFRα1）［5］、视黄酸激活基因8（Stra8）［6］刺激产生、胸腺细胞分化抗原1［7］、CD9［8］、转染期间重排的原癌基因（RET）［9］、干细胞关键蛋白［10］、DNA结合抑制因子4（ID4）［11］；阴性选择标记物：c-kit（CD117）和H-2Kb（主要组织相容性复合体1，人类MHC-1）［7，12］。人类SSC也表达很多和啮齿类动物SSC相同的标记物如：α6-整合素、GFRα1、Thy1等；但还有一些标记物是不同的，比如：Y染色体编码的睾丸决定因子蛋白（TSPY）［13-14］、黑色素瘤相关抗原4 （MAGE-A4）［15］、八聚体结合转录因子4（OCT4）［16］、阶段特异性胚胎抗原4（SSEA4）［10，17］、鼠类SSC不表达这些标记物，人类SSC一般也不表达β1-整合素。

作者单位：710061 西安，西安交通大学第一附属医院泌尿外科

Izadyar等［10］提出用SSEA4+CD49+的G蛋白偶联受体125（GFR125）+和低表达的C-kit选择出人类SSC，但是这些标记物的选择价值仍需要被实验证明。由于至今尚未找到SSC的特异性标志物，所以只能通过功能试验来证明SSCs的存在，现仅有的功能试验是通过SSC移植或细胞克隆培养技术来重建不育者的精子发生过程。

（三）SSC龛

SSC最重要的功能就是不断生成精子，在哺乳动物体内，精子形成是一个连续而又被精确调控的过程，其可被分为三个不同的时期：有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期。正常成人睾丸每天可产生4.5 ～ 20.7亿精子，生殖细胞的增殖并不是单由生殖干细胞调控而是由生殖干细胞的微环境（干细胞龛）决定的。

干细胞龛指的是：为干细胞提供营养支持作用并产生信号介导干细胞的自我更新和分化过程的微环境。干细胞龛可以通过不同的机制发挥作用：（1）与干细胞直接接触；（2）旁分泌产生各种因子直接作用于干细胞或通过中间细胞进行信息传递［18］。

睾丸中Sertoli细胞、管周肌样细胞、Leydig细胞和其它间质细胞共同构成了SSC龛，在卵泡刺激素的作用下Sertoli细胞可分泌对SSC自我更新有重要作用的因子GDNF。GDNF同时与RET和GFRα1复合受体结合后通过SFK/ PI3K/AKT途径介导细胞内蛋白激酶的信号传递过程，最终调控特定基因的表达，如与干细胞自我更新有关的基因：Etv5和Bc16b。其余的不受GDNF调控的基因如：Zbtb16，Taf4b和Lin28，可以通过其他的信号通路表达，而且其表达可能与抑制SSC的分化有关［19］。

二、SSC的移植与SSC库

（一）SSC移植：从鼠到人

SSC的丢失是导致男性不育的一个重要原因。放化疗的损害（1，20-22）或者先天性基因缺陷如47，XXY，Klinefelter综合征或精子相关因子的缺失［23-24］都能引起SSC的减少。青春期前儿童没有生成精子的能力，所以保存和移植SSC是这类患儿生殖保护的唯一方法［25］。

1994年Brinster和Zimmermann［26］首次报道了大鼠SSC的移植，将供体鼠的睾丸细胞混悬液移植到无生育能力的受体鼠睾丸组织内后，受体鼠重新获得了生精能力。不久之后，这项技术就在其他哺乳动物（包括灵长类）中得到了证实［27-30］。而且，在不同的种属之间，这项技术也获得了成功［31-32］。当然，当供受体之间遗传学的差距太大时，精子形成过程无法重新建立。由于人类SSC在大鼠睾丸内不能分化［31-33］，因此对人类SSC进行功能学评估目前尚不可能，因而开展人类SSC方面的研究仍旧很困难。但来自于其他哺乳动物，尤其是来自灵长类动物的研究结果表明了SSC移植技术的可行性，在不久的将来，有希望通过人类SSC的储存与移植来防治由SSC丢失导致的不育症。

（二）SSC库和肿瘤患儿生殖保护

为了使有关SSC移植的技术在临床应用，以下几方面的研究必不可少：首先，长期保存SSC或睾丸组织的方法是基础，干细胞重新移出并引入患者体内之前，需要保存较长时间，因此在保存期间维持细胞的活性与功能的重要性不言而喻。Avarbock和他的同事验证了冻存156 d的SSC在复苏后可恢复生精能力［34］。6年后，Izadyar和同事报道了包含SSC的A型牛精原细胞群（牛SSC）的低温储藏方法［35］。由于青春期前儿童和成人睾丸的结构和生长发育过程都不同，保持睾丸组织内干细胞龛中的细胞胞间联系，为干细胞提供一个相对稳定的内环境对干细胞生精能力的恢复至关重要。

研究者研制了多种用来保存青春期前人睾丸组织的方案。Kvist等［36］用慢速冷冻方案来冻存青春期前隐睾患儿的睾丸组织。他们选用的低温防护剂由1.5 mol/L的乙烯乙二醇和0.1 mol/L的蔗糖构成。Keros等［37］应用0.7 mol/L二甲亚砜作为低温保护剂的程序化慢速冷冻方案。Wyns等［38］用的是改进的Keros方案，其中增加了0.1 mol/L的蔗糖和10 mg/ml的人血清白蛋白，同时他们还评估了解冻后的SSC和Sertoli细胞的功能。从组织学角度来说，只有15%的SSC存活了下来，其中有32%具有增殖活性，相比而言，在低温储存和移植之前只有18%。Sertoli细胞的数量没有变化，但其中有5%正在增殖，而未冷冻和移植之前的Sertoli细胞则完全没有增殖。玻璃化冻存是一种用于保存卵母细胞和卵巢组织的有效方法，现在也被用于人睾丸组织的保存，初步结果表明，这种快速冷冻技术很有可能成为“控制性慢速冷冻”之外的另一种较为理想的方法。

体外SSC培养也作为一种可以替代低温储存的技术而被提出。Nagano等［33］报道了一种长期培养具有增殖与分化能力的SSC的方法，Kanatsu-Shinohana等［39］报道的体外SSC扩增技术，其完全不需要血清或饲养层就可以使SSC的数量大幅度增加，这是在临床成功移植的必要条件。

肿瘤患者自体移植目前面临的主要危险是肿瘤细胞的再扩散，所以移植前必须将SSC和恶性肿瘤细胞相分离，2005年Fujita等［40］报道了应用流式细胞分选技术去除大鼠睾丸组织细胞混悬液中的肿瘤细胞，他们声称在移植后的供体鼠内未发现有肿瘤细胞的存在。但从笔者和其他研究团队的实验结果来看，不论是应用免疫磁珠分选技术还是流式荧光激活细胞分选技术，通过PCR和免疫缺陷大鼠移植实验都可以检测到恶性肿瘤细胞的存在［41］。最近，笔者尝试利用选择性基质黏附鉴别镀层技术来富集生殖细胞和去除睾丸组织混悬液中的肿瘤细胞，但遗憾的是结果仍不尽如人意［42］。所以要让SSC移植在临床上应用，需要在SSC纯化及肿瘤细胞筛除方面做出更深入的研究。

在大鼠和小鼠进行SSC移植时，一般利用显微外科手术将SSC注入睾丸网，相比而言，人类的睾丸更大而且纤维组织更多，生精小管的排列也与啮齿类动物不同，因此目前基于啮齿类解剖结构的SSC移植技术并不适用于人类。Schlatt等［27］认为对于比较大的睾丸（如猴子，牛和人的睾丸）最好的方法是通过超声引导下睾丸网内注射技术，这也是损伤最小，灌注最有效的方法，其中所标记的细胞仅在近睾丸网处可以找到。Brook等［43］进而评估了在分离的人睾丸网中单次和多次注射的有效性，但在睾丸中的注射过程难以监测，而且，不能确定染色剂是注入了生精小管还是间质组织。在前期的实验中，B超造影剂（微泡），CT造影剂及印度墨汁的混合物通过多个位置（生精小管，睾丸网，副睾以及输精管）注射入睾丸切除术后离体的成年睾丸，在注射过程中使用B超监测注射位置和睾丸内造影剂的流向；注射后即刻行显微CT扫描来确定造影剂充盈的体积，最后对注射后的睾丸组织进行组织学检查，以评估注射的印度墨汁微粒是否到达生精小管内部，结果发现在睾丸网注射的睾丸组织中造影剂充盈的体积最大，并且有大量的墨汁颗粒到达了生精小管，证明B超引导下睾丸网注射可能是人类SSC移植的一个较为有效的方法［44］。

在啮齿类模型中SSC移植已被证实可以成功产生后代，但后代会因实验步骤的不同而导致基因型和表现型的差异，这需引起Goossens考虑和重视。Goossens等［45］观察到无论是体内受孕还是体外受精，相比正常大鼠来说，移植术后的大鼠后代体重会变小，但染色体组型和甲基化模式是正常的，另一研究深入分析了移植后所产生的精子的活动能力与浓度，发现其活动能力和浓度都是降低的。这也可能被用于解释为什么在体内受孕后产生的后代体重会减小。

考虑到精子形成过程中SSC微环境的重要性，移植睾丸组织有可能获得可以使卵子受精的有功能的精子。在观察了啮齿动物和兔类精子形成的全过程后，发现通过对移植了未成熟的睾丸组织的供者，可以通过辅助生殖技术得到有生育能力的后代。但将人睾丸组织移植入免疫缺陷大鼠后并未获得精子。笔者的团队发现将人睾丸组织移植到免疫缺陷的小鼠体内后，成人的SSC仍可以存活6个月，青春期前的睾丸组织，这段时期会更长（9个月）［46］。最近，有报道称在将青春期前儿童（13岁）的睾丸组织移植到大鼠体内后，可以发现初级精母细胞和少量次级精母细胞的存在［47］。

SSC移植可能面临的另一种危险是动物源性传染病，来源于动物的物质比如血清和饲养层常被用于保存人睾丸组织和细胞。来源于动物的病毒或细菌，可能感染人的细胞，再通过移植传播到人体内。这很有可能损害到受体及其后代的健康。为避免这种危险，在任何临床应用之前，需要实验是否可以用非动物源性的物质来代替。

三、SSC多能性与再生医学

最近的研究表明小鼠SSC具有增殖分化为所有3胚层的细胞的潜力，而且不需要先转换为去分化状态就可分化为：有功能的神经细胞、胶质细胞、心肌细胞和其它类型的成体细胞。Kanatsu-Shinohara等［39］报道在体外培养新生小鼠SSC可以得到ESC样细胞，这些ESC样细胞表达胚胎干细胞的表面标志物，并可以在诱导下在体外分化成不同类型的体细胞；这些ESC样细胞注射入裸鼠后产生可畸胎瘤，当注射到囊胚可产生子代小鼠。随后，Guan等［48］表明，从成年小鼠睾丸SSC在体外产生诱导产生多能细胞，并能分化成不同细胞类型的所有三种胚层的，并产生在免疫缺陷小鼠中形成畸胎瘤。类似的现象在人类的SSC中也被报道。Conrad等［49］建立了从成年人睾丸的SSC诱导的ESC样细胞系。该细胞系不仅获得了人类胚胎干细胞的细胞和分子的特性，而且能在体外诱导分化成各种类型的所有三种胚层的体细胞。这些研究表明SSC可能具有与胚胎干细胞类似的多向分化潜能，并且由于与胚胎干细胞和iPS细胞相比，SSC的伦理问题较少（无需破坏胚胎或创建用于治疗胚胎），并且可以制作患者自体特异的多能干细胞，因此具有更广阔的临床应用前景。

基于这些实验，以及SSC和造血细胞具有相同的胚胎起源这一基本事实，猜想小鼠SSC在体内也可能具有转分化为造血细胞的能力。在实验中，GFP+的雄性供体鼠的SSC被分离出后注射经白消安处理的GFP-雌鼠体内，12周后，收集受者小鼠的骨髓，外周血和脾内细胞并通过相关表型方法和功能试验进行评估可以在受体鼠骨髓、外周血中观察到供体鼠的细胞。不论在体内还是体外，这些细胞都表现出造血细胞的表现型和功能特征［50］。

SSC在体内分化的机制目前尚不清楚。一些研究者假定细胞的程序重排可能是转分化的一种机制。另一些人认为SSC可能在分化为特定细胞或组织之前会先去分化为多能干细胞。Izadyar等［51］提出多能干细胞的亚群Pou5fl+/C-kit+SSC和Pou5fl+/C-kit-SSC的不同是因为转分化时暴露于不同的微环境。在笔者的研究中，移植入受体鼠体内的SSC会在骨髓微环境即它们的新干细胞龛的“压力”下经历相似的过程，同时它们会被周围的间质细胞分泌的旁分泌因子诱导为“骨髓样细胞”。

以前的研究已表明大鼠SSC的可塑性和具有干细胞治疗的潜力。一些干细胞治疗方法，比如基于胚胎干细胞和诱导多能干细胞的治疗方法，由于伦理学的争议或致瘤性而具有局限性。相较于来源于同种异体的胚胎干细胞分化的细胞或组织，成体干细胞的转分化可能是一种更可行、更容易的方法。而且，这种方法比胚胎干细胞的研究在伦理学上的约束更少。人类SSC的储存和移植很可能成为未来男性生殖保存的临床常规方法，由此可见，基于SSC的治疗也具有很好的临床应用未来［52］。

四、前景展望

储存和移植SSC可能成为保留青春期前患儿生育能力极具前景的方向。他们需要在治疗前切除部分睾丸组织并低温储藏。在治愈后，保存的组织或细胞可以被移植回患者自己的睾丸内，继而有希望重新启动精子形成过程。对于肿瘤患者来说，则需要增加一些步骤先分离出SSC，移除恶性肿瘤细胞［46］。

将来的另一种选择是使移除恶性肿瘤细胞并分离出的SSC在体外成熟，通过这些方法，可以从大鼠的SSC获得有功能的精子，这些体外在产生的精子可以通过辅助再生技术使卵子受精［53］。上述方法也可以用于非梗阻性无精子症的成年患者，在分离并体外成熟后，来源于供者的SSC有能力产生有功能的精子。尽管如此，在临床上真正用于患者身上之前，还需要进行大量临床前研究。

人类SSC具有去分化为多能干细胞或转分化为其他类型细胞的潜力，这一点十分令人关注而且有可能为SSC的储存创造出新的任务。除了保存生殖能力外，储存的细胞也可能被用于其他患病器官的干细胞治疗，在SSC诱导分化为定向的细胞之前，通过添加已确定的生长因子或诱导间质，可以使SSC诱导分化为多能干细胞。另一种方法是在体内相应的损伤或患病部位，比如骨髓，心肌中直接注射SSC，但在将SSC可以做为多能干细胞替代来源之前，仍存在着一系列问题，其中最重要的挑战是从小块睾丸组织中获得足够的数量纯粹的SSC，大块睾丸组织（约1 g）至少包含5百万细胞，但仅有1 500个是干细胞，这距细胞治疗所需要的数量相去甚远，更何况去分化或转分化的成功率很低［54-55］。因此，分离SSC并在体外扩增的有效方法正在不断发展，一些体外扩增成人SSC的研究已经得到报道，但扩增的效率仍需要得到实质上的提高。

在临床上应用这些技术面临的另一项重要挑战就是避免移植后畸胎瘤发生的危险性。有效的诱导方案的发展和免疫系统的调节对减少畸胎瘤发生必不可少。尽管目前基于SSC的细胞治疗尚没有明确的临床应用预期，但未来SSC储存很可能成为十分具有前景和实用性的方法。

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55 Sadri-Ardekani H， Akhondi MA， van der Veen F， et al. In vitro propagation of human prepubertal spermatogonial stem cells［J］. JAMA， 2011， 305（23）：2416-2418.

（本文编辑：李少婷）

宁亮， 张倩倩， 杨林. 精原干细胞：生殖保护与再生医学的新来源［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016，6（4）：258-262.

Spermatogonial stem cells: new source of fertility preservation and reproductive medicine

Ning Liang， Zhang Qianqian， Yang Lin， Wu Dapeng， He Dalin.

Department of Urology， the First Affiliated Hospital of Medical School， Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710061， China

He Dalin， Email：hedl@mail.xjtu.edu.cn

Banking and transplantation of SSCs may become a promising method to preserve the fertility of prepubertal patients. According to recent discoveries， the potential of spermatogonial stem cells to de-differentiate into pluripotent cells or transdifferentiate into other cell types is possible and thus spermatogonial stem cell banking is useful. Several researchers have reported the derivation of multipotent cells from both mouse and human spermatogonial stem cells. These spermatogonia-derived stem cells show similarities with embryonic stem cells both for phenotype and functionality，indicating that these cells may be a promising alternative source for stem cell-based therapies in regenerative medicine.

Regenerative medicine； Spermatogonia； Stem cell transplantation；Cell Differentiation

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.012

国家自然科学基金青年基金项目（B1300551）

贺大林，Email：hedl@mail.xjtu.edu.cn

（2015-05-22）