三维细胞培养技术应用于肿瘤细胞的研究进展

詹世淮 雷艳 黄梁浒 谭建明

三维细胞培养技术应用于肿瘤细胞的研究进展

詹世淮 雷艳 黄梁浒 谭建明

三维细胞培养是一种模拟细胞在体内微环境生长的新兴培养技术。在三维支架中细胞能以三维空间的方式生长，并以三维方式与周围的微环境交互作用，能充分体现肿瘤细胞的黏附、侵袭及远端转移过程，可作为动物模型和二维培养模型之间的桥梁。三维细胞培养技术广泛应用于肿瘤模型构建、肿瘤细胞生理学研究以及肿瘤耐药机制分析等的研究。

三维； 细胞培养技术； 肿瘤细胞； 药物； 模型，结构

二维（two dimensional，2D）单层细胞培养技术为细胞和分子生物学的发展奠定了基础。但是这种经典的细胞体外培养模型与细胞真实的生长环境和生长方式还是有明显的差异［1］。三维（three dimensional，3D）细胞培养模型作为一种新的细胞培养方式，它能更好的模拟细胞在人体内的生长环境［2］。

3D细胞培养这一概念于1968年最早提出［3］，现在3D培养技术已应用于多种细胞系。3D细胞培养就是细胞以3D空间的方式在其中生长，并以3D方式与周围微环境中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、各种细胞因子、化学因子、物理机械力以及其它细胞发生交流与相互作用［4-5］。3D培养比2D培养的优势在于它拉近了细胞培养体系和细胞生理学之间的距离［6］。在2D模式下无法了解那些在体内对细胞的分化、增殖和功能起重要作用的ECM成分，细胞与细胞的相互作用以及细胞与ECM的相互作用关系［7］。三维模型的建立拓展了细胞培养的研究领域。

一、构建3D细胞生长模型的支架

目前构建3D细胞生长模型的方法很多，如使用低附着力的细胞培养皿、软琼脂胶、具有生物活性的基质胶、聚苯乙烯薄膜或人工设计的纳米纤维支架等［8］。3D细胞培养依赖的组织工程研究支架材料主要包括以几丁质、胶原、透明质酸类等ECM成分为代表的天然材料，以及聚酯类可降解聚合物（如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸乙醇胺和聚乳酸/羟基乳酸共聚物）等合成材料［9］。动物来源的天然生物材料，如胶原凝胶、糖胺聚糖具有与ECM相似的特性，能更好的模拟体细胞微环境，所构建的工程化肿瘤组织与体内肿瘤组织生物学特性相似，但往往有残存的生长因子、大量未鉴定的组分。组分明确的纳米自组装多肽支架材料弥补了这一缺点，如RGD多肽链交联海藻酸钠能提高支架材料的细胞黏附性能及生物活性［10］。

二、3D培养的肿瘤模型

（一）3D培养的肿瘤微环境

细胞周围的环境在细胞分化的命运与细胞功能方面起着关键作用。在进化上非常保守的局部微环境提供了细胞生存的外部屏障，它包括化学（如活性氧族、缺氧、低pH）、物理（如基底膜、间充质压力、组织张力）和生物（如免疫监视、抑制因子、ECM调节肽）等因素［11］。肿瘤微环境伴随着许多情况，健康的微环境有助于塑造细胞行为。

当口腔鳞状细胞癌细胞培养在聚乳酸聚缩水甘油合成的支架材料中时，体内外微环境发生了明显改变。3D培养时发现血管内皮生长因子的分泌增加了2倍，碱性成纤维细胞生长因子分泌增加了23倍，白介素8（IL-8）分泌增加了23倍。而IL-8的表达只在3D培养中见到，2D培养中不见表达，证明IL-8在血管生成中具有重要的作用。这改变了人们之前的观点，即2D培养中忽略了IL8在血管生成中的潜在作用［12］。

作者单位：350025 福州，福建省移植生物学重点实验室

（二）基于3D培养的肿瘤模型构建

目前国内外研究人员利用3D培养的组织工程技术，相继在体外成功构建了肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤等肿瘤体外研究模型。Lee等［13］以Matrigel 为支架材料，乳腺癌细胞系为种子细胞，体外构建了组织工程化乳腺癌组织，并与构建的正常乳腺组织相比较发现，正常乳腺细胞和乳腺癌细胞均能在3D立体生长条件下保持各自的细胞特性，再造的组织工程化肿瘤组织能够模拟肿瘤在体部分生物学行为。人卵巢癌细胞株SKOV3细胞骨架戴在3D支架中间充质特性的表达比上皮特性增加，再造的肿瘤样组织在体内具有较高成瘤性［14］。Wang 等［15］将人乳腺癌培养在多孔丝蛋白胶原支架上，研究乳腺癌细胞的侵袭与浸润，并探讨了相关的分子机制。

（三）基于3D培养的肿瘤模型特点

在3D培养条件下肿瘤细胞的生长与体内肿瘤的生长类似，都能形成中央坏死层，内部休眠层和最外增殖层，特别是在肿瘤生长的早期阶段，在3D培养时能观察到空心芯，这类似于体外肿瘤的坏死区。此外，3D培养条件下肿瘤细胞的增殖指数较低，2D单层培养和3D培养的肿瘤细胞的代谢差异明显不同［16］。当用药物作用于3D肿瘤球体和动物模型时发现两者反应相似，这可能是因为他们都是通过黏附和分泌可溶性因子增强细胞间的相互作用而导致pH降低和缺氧。3D肿瘤球体的耐药性被认为是类似于烷化剂作用于体内肿瘤细胞。据观察，在3D球体培养时小鼠乳腺癌细胞系耐各种烷化剂，但是在单层培养时并没有表现出耐药性。与单层培养相比，MCF-7和DLD-1细胞球体对抗癌药物紫杉醇的IC50增加了100倍［17］。

三、3D培养研究肿瘤细胞

（一）肿瘤细胞生理学的应用

3D细胞培养有助于更好地理解肿瘤细胞的各种功能，如细胞形态、增殖、黏附等。

1.肿瘤细胞形态与侵袭性：传统2D单层和3D支架培养的细胞形态明显不同。乳腺癌细胞株2D培养时未表现出典型形态，但当培养在lrECM 3D支架中时，能表现出圆形、块状、葡萄样和星状4种形态。MDA-MB-231乳腺癌细胞在Ⅰ型胶原水凝胶中培养3 d，细胞呈星状，形态细长并且核不规则，并能表现出肿瘤细胞的侵袭性增殖至整个水凝胶中形成细胞集落［18］。将肾腺癌细胞株Renca封装在琼脂糖支架中，与2D培养中的上皮样形态明显不同，3D培养条件下，细胞大而不规则具有较高的胞核比，或小而圆胞核比较低，这些细胞能形成活性更强、更大的肿瘤集落［19］。

2.肿瘤细胞增殖与细胞周期：人宫颈癌上皮细胞培养在由聚苯胺的合成的纳米3D支架中，与2D培养的细胞相比，更多细胞停滞在G0/G1期，处于S期细胞减少［20］。3D培养系统中细胞是非单层生长，其能生存更长时间且增殖率更慢。将TC-71尤文肉瘤细胞分别培养在2D单层和3D PCL支架中，发现在3D支架中，瘤细胞生长明显减慢［21］，该研究突出了3D培养的优点，由于其减少孔隙和纤维直径、表面积大，可用于精确评价细胞增殖。

3.细胞黏附和信号传导：多细胞生物体的细胞生长在一个极其复杂的环境中，周围有其他的细胞和结构良好的基质，与周围细胞和基质的信号传导与黏附能控制细胞行为。2D与3D培养的细胞在信号传导途径方面显著不同。

粘连蛋白是介导细胞信号转导，迁移和黏附的多蛋白体。包括vinculin，talin，FAK等在内的粘连蛋白，都存在于3D培养系统中，通过影响基质变形而调节细胞的增殖速度和活性。A549和ut-scc15细胞在3D培养体系、传统的2D单层和层粘连蛋白丰富的ECM（lrECM）中培养的细胞形态差异显著，在这三种不同的培养体系中，前4天细胞群体的倍增时间相似。但对与细胞黏附，生物黏附，免疫反应和组织发育相关的基因表达有差异［22］。

在细胞信号传导方面，分别培养在2D与3D条件下，3D培养的尤文肉瘤细胞高表达细胞胰岛素样生长因子受体Ⅰ（p-IGF-ⅠR），IGF-ⅠR/mTOR信号通路异常表达，而PIK3/Akt信号通路表达降低［23］，这与它们的迁移速度和增殖率降低的结果一致。

（二）肿瘤细胞对辐射敏感性的应用

具有相同遗传背景的2D生长细胞与3D生长细胞的辐射敏感性及DNA损伤修复能力不一样。在接受同等计量的X射线辐照后，3D生长的人肺癌细胞及人头颈部鳞状癌细胞与它们各自的2D生长细胞相比，未修复的DNA双链断裂（DSB）位点比例降低，细胞存活率更高，表明3D培养细胞与2D培养细胞相比具有一定的辐射抗性［24］。但具体的机制尚不清楚，薛刚等［25］对表观遗传学调控介导2D与3D生长癌细胞的辐射敏感性差异的研究正好解释了A549细胞辐射抗性的原因。与2D培养的细胞相比，培养在Matrigel基质胶中的A549细胞X射线辐射后miR-1915及DNA甲基化酶（DNMT1和DNMT3b）的表达量明显下调，组蛋白乙酰化酶Tip60的表达量上调，具有重编程功能的转录因子表达显著上调而使癌细胞获得了干性，从而增加了对辐射的抗性。生长环境的差异诱导2D与3D生长细胞表观遗传改变，表观遗传调控上的差异导致2D与3D生长癌细胞之间的DNA损伤修复差异，从而介导了他们之间的辐射敏感性差异。

（三）肿瘤细胞对药物耐药性的应用

2D药物测试体系提供的信息有限，并往往具有误导性，而动物模型饱受伦理学的争议，3D细胞培养技术有望作为二者的桥梁，在提高细胞的药物筛选和识别毒性及鉴定无效的物质成分方面具有更大的潜力。

药物筛选研究需要一个真实的体外模型，可以有效地模仿肿瘤组织和帮助测量其体内药物反应。而2D细胞培养缺乏这方面的要求。口腔鳞状癌细胞分别培养在3D 聚乳酸聚缩水甘油支架和2D条件下，并经细胞毒性药物PI3激酶抑制剂LY294002处理。2D培养时，细胞对LY294002很敏感，而在3D环境中表现出了明显的药物抵抗性［12］。将拥有相似遗传图谱的乳腺癌细胞系（AU565，SKBR3，hcc1569，和BT549）分别培养在传统的2D单层和lrECM 3D基质中，并分别给予曲妥单抗、帕妥珠单抗（单克隆抗体靶向HER2），拉帕替尼（HER2和EGFR双重抑制剂），所有3D培养的细胞株都表现出了更强的药物抵抗性，同时我们也观察到在两种培养条件下，每个细胞系对药物的应答反应各不相同［26］。这表明，当培养在lrECM 3D基质中时，每个细胞系可能表现出不同的信号转导途径。这样的结果为我们提供了深入了解每个类型癌症的具体要求，适用于特定的研究。

TC-71 EW肿瘤细胞分别培养在传统2D单层和PCL 3D支架中时对阿霉素具有不同的应答。培养在3D支架中的TC-71 EW肿瘤细胞对阿霉素有较强的抵抗性，其IC50为2.738mM，而培养在传统2D单层中的TC-71 EW肿瘤细胞对阿霉素的抵抗性降低，其IC50为0.0122 mmol/L［20］。抗化疗药物，如顺铂、吉西他滨、5-FU、喜树碱作用于培养在传统2D和3D支架中的NSCLC细胞，研究结果表明，3D培养下的IC50值更高。抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的结果显示，与3D培养相比，H1650 和H460细胞株在2D条件下凋亡的更多，且抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达更少［27］。3D培养是一种更接近体内的培养系统，它为药物的开发和试验提供了更好的平台，他能更好的实现对药物安全性和风险性的评估。

四、结语与展望

传统的2D培养技术在细胞与微环境的复杂交互作用方面存在诸多的局限性，随着3D细胞培养的提出，更接近体内真实的生长环境，在许多方面体外研究更接近动物模型。3D细胞培养可以更好地对肿瘤细胞的生长、转移和信号转导等进行观察，对肿瘤的发生发展进行研究，还可通过3D模型了解其对放化疗的敏感性以及药物的筛选。随着3D细胞培养技术的发展，其在肿瘤药物开发，深入理解肿瘤细胞生理，基因和蛋白表达及癌症研究方面具有广泛的前景和重要的价值。

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（本文编辑：李少婷）

詹世淮，雷艳，黄梁浒，等.三维细胞培养技术应用于肿瘤细胞的研究进展［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版，2016， 6（4）：248-251.

A review of three dimensional cell culture systems for tumor cells

Zhan Shihuai， Lei Yan， Huang Lianghu， TanJianming.

Fujian Provincial Key Laboratory of Transplant Biology， Fuzhou General Hospital， Fuzhou 350025， China

Tan Jianming， Email： Tanjm156@xmu.edu.cn

3D cell culture is a new technology which can more accurately simulate the growth microenvironment of cells in vivo. Cells grown in three dimensional scaffolds interact with the surrounding microenvironment. 3D cell culture can fully reflect cell adhesion， invasion and metastasis， which is expected to bridge the gap between 2D culture and animal models. Here we review the current advances in cell physiology research， cancer drug resistance mechanism analysis and the construction of tumor model based on 3D cell culture.

Three-dimensional； Cell culture techniques； Cancer cell； Drug；Models，Structural

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.010

国家自然科学基金资助项目（81270431）

谭建明，Email：Tanjm156@xmu.edu.cn

（2016-05-23）