糖原合酶激酶-3β与心肌疾病的研究进展

张丽波，周立君

· 综述 ·

糖原合酶激酶-3β与心肌疾病的研究进展

张丽波1，周立君1

糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调节多种细胞功能，包括代谢、转录、翻译、细胞生长和凋亡［1］，GSK-3β在心肌细胞的生长与凋亡中也扮演着重要角色，参与调控心肌细胞肥大［2，3］、心力衰竭（HF）［4，5］、缺血再灌注损伤（I/R）［6-8］、心肌纤维化［9，10］，本文就其与心脏疾病的发生、发展进行总结。

1　GSK-3家族概述

GSK-3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛表达于多种细胞中，1980年首次被鉴定出参与调节糖原代谢，并且是糖原代谢的限速酶。1990年，基于部分多肽序列首次克隆出GSK-3基因［11］。GSK-3高度保守，从果蝇到人类GSK-3激酶结构域序列上有90%以上的同源性［12］。GSK-3家族包括两个亚型，即GSK-3α（51 kDa）和GSK-3β（47 kDa），二者的激酶结构域有98%的同源性，主要区别在于N端和C端，GSK-3α包含一个功能不明的富含甘氨酸的N末端。所以这种在激酶结构域异常高的同源性有可能阻碍研究异构体小分子抑制剂的发展前景。两种亚型既有重叠功能，又有各自的独特性［13］，例如：只有GSK-3β在Ser389/Thr390位点磷酸化；GSK-3β在AA-13具有神经元特异性剪切位点；某些作用底物具有亚型特异性。此外，两种亚型全基因删除的生物表型亦有差异，在小鼠模型中，全基因删除GSK-3β是胚胎致死性的，但缺失GSK-3α基因型的小鼠是正常的并能存活数年［13］。

2　GSK-3β活性的调节

GSK-3β参与很多生理或病理过程，包括细胞新陈代谢，细胞的增殖、凋亡、迁移、细胞周期的调节，蛋白质翻译和基因转录等，是众多细胞信号转导途径的交叉汇点，要完成如此多的功能，GSK-3β活性必然受到极其复杂且精细的调节［14］。

2.1GSK-3β的磷酸化调节 GSK-3β N端的第9位丝氨酸（Ser 9）磷酸化可显著抑制其活性，丝氨酸残基的磷酸化使GSK-3β的N端自身变成假底物，从而占据真正底物的起始磷酸盐保留的结合位点［15］。蛋白激酶B（PKB/Akt）/GSK-3β信号通路是最常见的磷酸化调节通路，Akt的激活常依赖于其上游分子磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的活性，PI3K激活Akt，Akt磷酸化下游信号分子GSK-3β N-端的Ser9而抑制其活性，随后激活下游靶点，发挥细胞调节作用［16］。此外，哺乳类雷帕霉素靶蛋白复合物-2（mTORC2）磷酸化Akt的第473位丝氨酸位点可完全激活Akt［17］。多条信号转导途径均经过GSK-3β的Ser9磷酸化位点，例如蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、核糖体S6激酶体系（p90RSK和p70S6K）等。近几年有研究报道［18］，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通过磷酸化GSK-3β C末端Ser389和Thr390抑制其活性，具体机制尚未完全清楚。与N端丝氨酸磷酸化的抑制作用相反，磷酸化GSK-3β C端第216位酪氨酸残基（Tyr216）可促进其活性［19］。

3　GSK-3β与心肌疾病

3.1GSK-3β在心肌缺血再灌注（I/R）损伤中的作用 缺血再灌注损伤是缺血组织器官在恢复血流后，其细胞代谢紊乱、功能障碍及结构破坏反而加重的现象，近年来减轻I/R损伤以获得更有效的心肌保护一直是心脏研究的一个主要方向。大量研究表明［24］，GSK-3β Ser9磷酸化对于缺血预适应的心肌保护作用是必须的。Juhaszova等［25］报道抑制GSK-3β活性会延迟线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，这对心肌保护有重要影响。该研究团队应用小分子RNA干扰技术同样证明了保护性信号通路主要是GSK-3β亚型介导的，而与GSK-3α无关。Ludovic等［26］用GSK-3β-Ser 9转基因小鼠证明GSK-3β Ser9磷酸化对于缺血后的保护作用亦是重要的，并且通过一种非依赖亲环蛋白D（cyclophilin-D，CypD）的模式抑制mPTP开放来产生这种作用。有报道［27］称磷酸化GSK-3β在线粒体内膜与腺嘌呤核苷酸移位酶（ANT）结合增加，使ANT和CypD的相互作用减少来升高mPTP的开放阈值发挥心肌保护作用。然而GSK-3β在线粒体通透性转换孔调控靶点尚不清。

Woulfe等［28］应用可诱导型的心肌细胞特异性的GSK-3β基因敲除小鼠模型证实心肌细胞GSK-3β的敲除对陈旧性心肌梗死有保护作用。GSK-3β敲除鼠模型（GSK-3β KO）可以减少心室重构、保护左室和减轻心肌梗死后心脏扩张。这种保护作用并未通过减少GSK-3β KO模型心肌的梗死面积发挥，因为应用的是永久性闭塞的心肌梗死模型，也就是梗死已经完全形成后才敲除该基因。在GSK-3β KO心肌梗死模型中观察到外层心肌的肥大更倾向于生理性而非病理性。

但有些研究发现GSK-3β对缺血性心肌的作用与前面研究结果大相径庭。Webb等［29］建立持续激活GSK-3α和GSK-3β基因的双植入（double KI）小鼠模型，结果显示二者的持续活性对心肌梗死后慢性压力重构无影响，这说明局部心肌梗死后的左室重构和GSK-3无关。最近Peiyong等［30］通过应用GSK-3β转基因小鼠验证不管是单纯延长缺血亦或再灌注后短暂的缺血GSK-3β在心脏中的作用，表明抑制GSK-3β会加重缺血损伤，但可以通过调节mTOR通路及自噬功能来对抗缺血再灌注损伤，即自噬功能改善缺血延长及再灌注时GSK-3β产生的心肌损伤作用。总结来说，现有的文献表明GSK-3β调节心室功能的作用很复杂，该激酶过表达或过度激活是有害的，但若完全抑制其活性，同样产生弊端。在GSK-3β抑制剂作为临床治疗缺血相关心脏病药物之前，仍需深入的临床研究作为保证。

3.2GSK-3β在心肌肥厚中的作用 作为终末分化细胞，心肌细胞通过代偿性肥大来适应各种生理或病理负荷，如：锻炼、高血压等。众所周知，生理性的肥大可以通过增加耗氧量和搏出量来增强心功能，但病理性肥大多与心肌纤维化增加、细胞死亡和心功能不全有关且可致心力衰竭［31］。

Haq等［32］和 Morisco等［33］首次发现GSK-3β是心脏肥大的负性调控因子。Antos等［34］研究发现腺病毒转基因GSK-3β-Ser9突变模型的心肌细胞能显著抑制心肌对肾上腺素及内皮素-1刺激而引起的肥大反应。该研究团队还建立了转基因小鼠模型，并在心脏特异性启动子的控制下使GSK-3β持续激活，在压力超负荷模型和慢性β肾上腺素刺激模型中心脏特异性表达活化的GSK-3β都能起到减弱心脏肥大的作用［34］。另外，有研究报道在心肌细胞过表达GSK-3β，GSK-3β的持续激活使正常出生后心肌细胞死亡增加，并导致心脏缩小及伴有收缩功能显著异常［35］，证明GSK-3β可以调节正常和病理状态的心脏生长发育。这些研究证明了GSK-3β是心脏肥大信号通路的负性调节因子，提高心脏GSK-3β的活性可能在病理性肥大的治疗中增加临床获益。

近年来有研究表明MicroRNA（miRNA）能从转录后水平调控GSK-3β的表达，miRNA是一组广泛存在于真核生物中短小、不编码蛋白质的单链RNA。Nagalingam等［36］利用去氧肾上腺素（PE）刺激培养的原代心肌细胞，发现miRNA-378的过表达抑制PE诱导的Akt/GSK-3β的磷酸化，下调活化T细胞核因子（NFAT）核内活性，抑制PE诱导的心肌肥厚。Li等［37］研究表明miRNA-145下调心肌转录因子6（GATA6）在核内的表达和定位，抑制异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌肥厚，其对心脏的保护作用与抑制蛋白质合成的多条信号通路有关，包括Akt/GSK-3β、ERK1/2、JNK等，在基因水平抑制心肌肥厚。

3.3GSK-3β在心肌纤维化中的作用 纤维化可以影响机体大部分组织，严重的纤维化甚至导致器官功能障碍和死亡。心肌梗死后诱发心肌纤维化、心室扩张、心功能障碍等都与心肌成纤维细胞的过度激活有关。

已有研究报道［38，39］，GSK-3β通路和成纤维细胞转化成心肌纤维细胞及纤维化信号转导均有关，靶向抑制成纤维细胞中的GSK-3β证明缺失GSK-3β导致过度纤维化及不良的心肌梗死后心室重构。GSK-3β调节心肌纤维化的机制可能有：①GSK-3β调节TGF-β1-SMAD-3信号通路，TGF-β是成纤维细胞激活的关键调节因子，TGF-β1与受体结合后作用于SMAD转录因子的C末端结构域使其磷酸化和激活，GSK-3β通过负性调控SMAD-3活性而起到抗纤维化作用［40］；②通过Wnt/β-catenin信号通路，β-catenin在系统性硬化中是纤维化发生的中心调节因子，抑制GSK-3β的活性，减少β-catenin的泛素化降解，导致众多器官成纤维细胞激活和纤维化［41］。

3.4GSK-3β在心肌细胞凋亡中的作用 细胞凋亡是在多种生理性或病理性刺激下，为维持内环境稳定，细胞信号转导通路激活启动细胞凋亡蛋白酶级联反应，导致细胞的程序化死亡。心肌细胞在受到缺血、缺氧、压力超负荷、线粒体毒素、长期酒精摄入等刺激下，会引起心肌细胞凋亡，长期而持续的凋亡导致心室重构，进而发展为心力衰竭［42］。GSK-3β在细胞凋亡与生存调节中发挥重要作用。GSK-3β的激活促进线粒体途径诱导的内源性细胞凋亡，但是抑制由死亡受体（TNF-R1，Fas，DR4，DR5）介导的外源性细胞凋亡［43］。线粒体凋亡通路起始于mPTP的开放，释放细胞色素C于胞质中，进而激活Caspase-9及下游半胱天冬蛋白酶的级联反应，导致细胞凋亡，而mPTP的开放阈值随着GSK-3β活性降低而升高［23］。

Mokhtari等［44］研究糖尿病大鼠在缺血再灌注条件下，给予曲克芦丁150 mg/kg/天灌胃4周，发现曲克芦丁通过增加GSK-3β的磷酸化抑制其活性，减少再灌注损伤时的细胞凋亡。Daniels等［45］在应用ISO诱导的小鼠心肌重构模型中发现β肾上腺素受体（β-AR）刺激可提高细胞外泛素化水平，可使Akt活性升高，随之磷酸化GSK-3β-Ser9，抑制c-Jun氨基末端激酶（JNKs）的活性，减少心肌细胞凋亡，改善心室重构。有研究发现在敲除乙醛脱氢酶-2小鼠模型中，急性乙醇摄入加重心肌细胞凋亡，心脏收缩功能障碍，这种损伤是通过蛋白磷酸酶2A介导的Akt/GSK-3β脱磷酸化作用［46］。由此，可以推断GSK-3β的过表达可以促进细胞凋亡，抑制GSK-3β的活性有可能保护组织器官。

4　小结与展望

综上所述，GSK-3β是细胞内多条信号转导通路的交叉点，其在心脏疾病的保护作用受到越来越多的关注，然而，目前关于GSK-3β的大多研究都集中于靶向基因敲除的细胞和实验动物模型，尚未发现在人类心脏疾病的临床研究中发挥同样的保护作用。而且，GSK-3亚型具有高度同源性，阻碍了药理学方面研究特异性的靶向分子抑制剂，期待将来能够应用RNA干扰方法或单克隆抗体方法研发具有活性靶向位点的小分子抑制剂。

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本文编辑：姚雪莉

R541 【文献标志码】A

1674-4055（2016）04-0507-04

1150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院

周立君，E-mail：Zhoulj0451@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.38

2.2Wnt信号通路的调节 Wnt信号通路是在物种进化过程中高度保守的信号通路，在动物胚胎的早期发育、器官形成、细胞的增殖和凋亡、肿瘤的生长和转移等过程中，发挥至关重要的作用［20］。GSK-3β结合蛋白复合体包括：骨架蛋白、GSK-3β、β连环蛋白、腺瘤性结肠息肉蛋白（APC）等，GSK-3β是Wnt信号通路中的关键蛋白，其激活与抑制决定细胞的命运，主要靶目标是β连环蛋白［21］。简单来说，在没有Wnt信号刺激时，GSK-3β以活性形式磷酸化β-catenin 的Thr41、Ser37和Ser33，导致其泛素化降解，阻断β-catenin介导的蛋白质合成。然而，生长因子结合Wnt受体触发脂蛋白受体相关蛋白（LRP5和LRP6）的磷酸化，从而激活蓬乱蛋白1（Dvl），进而促进GSK-3β与β-catenin的解聚，β-catenin转移至细胞核内并与核基因TCF /LEF相互作用发挥调控基因转录作用。

2.3Calpain介导的GSK-3β片段化调节 GSK-3β活性不仅受到磷酸化、结合蛋白的调节，近年研究报道［22］，钙激活中性蛋白酶对GSK-3β N端的片段化可导致GSK-3β的抑制结构域丧失，并将GSK-3β分解为两个分子量为40kDa 和30kDa具有激酶活性的片段，即Calpain的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高。Shanshan Ma等［23］研究发现，Calpain还可使GSK-3β的C末端分解为几个片段，导致活性升高，并证实其片段化位点在Thr-38-Thr-39和Ile-384-Gln-385，Ser-9/Ser-389位点磷酸化可使Calpain介导的GSK-3β片段化作用减弱。目前Calpain对GSK-3β片段化调节机制尚未完全清楚，还需进一步研究。