手术前后评价肾细胞癌新生血管的方法

崔 涛， 葛明珠， 张志峰

综述与讲座

手术前后评价肾细胞癌新生血管的方法

崔 涛， 葛明珠， 张志峰

肾细胞癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，研究评价肾细胞癌新生血管系统，有助于了解肾癌的生物学特性，对肾癌的早期诊断、鉴别诊断、治疗、转移及预后评估等均有重要意义。手术前后评价肿瘤新生血管的方法不同，其中微血管密度检测、定量检测肿瘤新生血管生长因子和相关因子的表达属于回顾性研究，需要在术后取得组织标本的基础上进行，而超声具有血流检出率高、无创伤、可重复性等特点，可作为评价肾癌新生血管的首选方法。

肾细胞癌； 新生血管； 超声； 造影； 免疫组织化学； 诊断

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)简称肾癌，是最常见的肾脏恶性肿瘤，约占成人肾脏恶性肿瘤的85%[1]，占全身恶性肿瘤的1%～2%，属于多血管实体肿瘤[2]。当前以手术治疗为主，对放、化疗不敏感，预后欠佳。实体肿瘤在其增殖过程中，需要形成新生血管系统来供应肿瘤细胞所需要的养分和氧气；同时，也需要新生血管为癌细胞的扩散提供条件[3]。研究评价肾细胞癌新生血管系统，将有助于了解肾癌的生物学特性，对肾癌的早期诊断、鉴别诊断、治疗、转移及预后评估等均有重要意义。

当前，评价RCC新生血管的方法大体可分为两大类：第一类，手术前应用影像学技术来宏观地评价肾癌的新生血管，其中有创检查包括血管造影、数字减影血管造影、超声造影等；无创检查是应用多普勒超声等技术，这些检查能够显示RCC内血管的大体形态、分布、走行，测量血流速度、阻力指数、搏动指数等参数，量化血管，并可观察肾静脉、下腔静脉内有无癌栓及周围有无淋巴结转移等情况。第二类，手术后取得肿瘤组织标本，在此基础上应用免疫组化技术为主要方法，检测肿瘤微血管密度(micro vessel density，MVD)和多种血管生长因子及相关因子在肾癌中的表达。现结合相关文献将这两类不同的评价方法及临床意义详细陈述如下：

1 手术前应用影像学技术评价肾细胞癌新生血管的方法

1.1 有创检查肾癌新生血管方法

1.1.1 血管造影及数字减影血管造影(DSA)技术 血管造影自问世以来，技术不断发展、改进，能诊断出早期和微小肾脏病变。但由于脊柱、肋骨和肠道积气等的阴影遮挡，影响了其诊断的准确性。DSA利用电子计算机与分层摄片相结合的方法，弥补了血管造影的不足，可去除脊柱、肋骨和肠道积气的阴影，使血管显示更清晰，足可观察到肾实质内直径<1 mm的血管，且造影剂用量减少，降低了药物副作用的发生率。经肾动脉数字减影血管造影，出现以下三方面的表现时提示肾细胞癌[4]：第一，肾动脉主干增宽，直径大于0.75 cm，提示该肾有高血供的占位性病变。第二，病灶内可见迂曲、粗细不均的血管影和分布不均的新生血管，且常密集成团，肾内血管移位、侵蚀和中断，此表现特异性较高。第三，可见肿瘤血管“包绕征”及高密度的肿瘤染色，肿瘤边界与肾组织分界不清。血管造影显示90%以上肾细胞癌可见密集成团的肿瘤血管[5]。但血管造影或DSA在现阶段均无定量分析肾癌新生血管的手段，不能为肾癌的诊断提供较客观地依据。血管造影和DSA有别于其他肿瘤血管检查方法的优势是：可在检查的同时进行肾动脉栓塞治疗，使肿瘤发生梗死，体积变小，减少术中出血及肿瘤细胞播散，提高手术治疗机会，对无手术机会的肾癌患者可以减缓肿瘤产生的症状，稳定和改善全身情况。

1.1.2 超声造影技术 经外周静脉使用造影剂后可以增强血液的回声强度和多普勒信号强度，提高彩色多普勒超声对低速血流的检查率，实时观察肿瘤内微血管的血流灌注全过程，动态观察肾脏血流的实相变化。超声造影能更显著的增强肾细胞癌血流信号，而且其增强形式有一定的规律，为肾细胞癌的定性诊断提供了重要信息。不同的造影剂增强表现不同，注射Levovist造影剂，肾良恶性肿瘤内的血流显示都增强，但肾细胞癌的血流显示增强快速出现而且持续时间长，可能与肾动脉血流速度加快，肿瘤内血管迂曲流速减慢有关[6]。注射SonoVue肾细胞癌在动脉期快速增强，静脉期快速消退[7]。戴晴等人[8]报道超声血管造影提高了RCC内血管检出的敏感性，有助于肾细胞癌的早期诊断、鉴别诊断及手术方案的制定。而且随着超声造影剂的不断更新研发，超声造影不仅应用于肿瘤的临床诊断，在靶向治疗方面也有很大的前途，将微泡药物或基因载体结合在造影剂微泡内，借助超声将药物或基因转运至肿瘤组织内起到治疗肿瘤的作用[9]。

1.2 无创检查肾癌新生血管方法

多普勒超声具有多种技术可用于肿瘤血管的研究，尤其是随着新技术的不断出现，不仅可以显示肿瘤内血管走行、分布，测量相应参数，还可对肿瘤内血管进行定量计数分析，使得超声在研究肿瘤新生血管方面的应用更加广泛。

1.2.1 彩色多普勒血流显像(CDFI)技术 CDFI可同时兼顾血流动力学与二维超声图像，实时显示肿瘤的血供情况和肿瘤内血流的分布，能反映一定的血流动力学变化，为肾良恶性肿瘤的鉴别诊断提供依据。正常肾脏CDFI显示，各级动脉逐级分支清晰，似呈树枝状，走行平直、规整，分支逐渐变细。由于肿瘤内的缺氧微环境等因素影响，肿瘤新生血管呈持续性生长，表现为扩张迂曲及不规则的狭窄等。CDFI显示大多数肾癌的血流分布及形态具有明显的异型性[10]，环形血流信号位于肿块周边，肿瘤中心血流信号丰富。董磊等人[11]研究显示，依据CDFI诊断小肾癌的符合率约85.7%。CDFI技术快捷、无创、价格低廉，可作为肾癌术前的首选筛查方法[12]。但传统的CDFI技术对低速末梢血流、血供少或是位置深的病灶显示不理想，随成像参数的改变，容易出现血流信号外溢或显示不全等缺陷而影响肿瘤血供的评价结果。

1.2.2 脉冲多普勒技术(PW) PW是在彩色多普勒血流成像的基础上，分析肿瘤血管及肾动脉血流频谱的特点，测量血管速度、阻力指数(RI)、搏动指数(PI)等参数，为肾细胞癌的诊断及鉴别诊断提供定量分析指标。其中测量角度不会影响RI和PI数值大小，可真实的反映肾血管及病灶内血管的血流动力学状态。肾细胞癌中肾动脉的平均峰值流速显著高于正常人和肾良性肿瘤的肾动脉平均峰值流速。大多数肿瘤实质内及周边可以检测到动静脉瘘及双向血流频谱，肾细胞癌病灶周边血流RI>0.7，肿瘤内RI<0.6。有研究指出，肾恶性肿瘤的血流阻力指数在0.5左右，良性肿瘤在0.6左右，鉴别肾良恶性肿瘤可以RI<0.5作为分界值[13]。

1.2.3 彩色血管能量成像(CPA)技术 CPA是利用血流中红细胞密度、散射能量成像，因CPA对声速和血流的夹角没有依赖，不出现混叠现象，能显示低速、低流量的血流，对血流显示的灵敏度是CDFI的3～5倍。在二维超声图像清晰的基础上启动彩色血管能量成像，能清晰的显示肾脏皮质内血管细小分支的血流信号，并检测出肿瘤内粗细不一、不同方向弯曲绕行的低速血流信号。王丽春等[12]联合应用CDFI和CPA诊断小肾癌，使其诊断准确率大大提高。使用CPA评价肾细胞癌的血供特征还有助于肿瘤的鉴别诊断。目前，使用CPA技术观察肿瘤内血管后，选择彩色血流信号最丰富的图像储存，再用Auto CAD软件即可计算出癌组织单位面积内的彩色血流，即彩色血流平均密度(MCVD)。MCVD是能够反映肾癌新生血管丰富程度的定量指标。肾细胞癌的MCVD和MVD具有良好的正相关性，随着肾癌病理组织学分级的升高，其彩色血流平均密度值也呈增高趋势[14]。说明MCVD能够较好的反映肾癌的整体血供，并与术后肿瘤血管病理情况一致，可作为一个术前评价肾癌新生血管的定量参考指标，对临床具有指导意义。随着研究的进一步深入并规范MCVD值的测量，这一指标将具有更深远的使用价值。

1.2.4 三维彩色血管能量成像技术(3D-CPA) 3D-CPA是在能量多普勒的基础上，应用超声三维重建技术对器官及肿瘤内的血流进行空间立体成像。3D-CPA除具备CPA的显像优点，还弥补了CPA只能二维平面显示血流的缺点，能够更直观、立体地显示肿瘤血流信号，能连续动态地观察肿瘤内部及周边的血供情况，是目前唯一能重复、无创、立体显示肿瘤血管的技术。应用3D-CPA技术研究肾细胞癌发现，大部分肾细胞癌血管丰富，分支复杂，呈分叉状或网状，整体表现为“珊瑚”样血管树。在此基础上计测肿瘤单位体积内的血管条数即血管指数(VI)，肿瘤的血管条数包括肿瘤内部及周边的血管，以末梢血管的分支数计算血管数。血管指数是评价肾癌新生血管的定量参数，能较客观、精确地反应肿瘤新生血管的情况。研究表明，肾癌的VI与其MVD有很好的相关性，且随着肾癌恶性程度地增高，血管指数升高[15]，以Ⅲ期和Ⅳ期肾癌的血管指数增高为显著[16]。血管指数对肾癌的术前诊断和预后的判断有重要的指导意义。

1.2.5 低速血流成像技术(SMI) SMI是新近出现的评价组织微血流灌注的一种方法，其基本原理是应用自适应图像处理技术，根据微细血流和人体组织细小运动产生的频谱信号的混杂分布区域的差别处理滤波，将血流信号和重叠的组织运动伪像区分开，保留最确切的低速血流信号，不需利用造影剂便可实现极低流速细小血管的可视化。SMI的特点：极佳的低流速血流成像，极少的运动伪像，卓越的空间分辨率和血流敏感度，成像帧频高、实时性好。由于SMI技术显示的是低速血流，在操作过程中我们需要尽量保持稳定，以防探头相对于血管移动速度过大，引起运动伪像，影响检查结果。目前，SMI技术检查可以检测出乳腺恶性肿物中潜在的微血管，为鉴别肿瘤的良恶性提供可靠的参考依据。还可以用于评价甲状腺、肝、肾占位性病变以及增大淋巴结的血流微灌注情况，有助于分析病变性质。在肾细胞癌中的应用还没有文献报道，可作为我们下一步的研究方向。

2 手术后免疫组化技术评价肾细胞癌新生血管的方法

2.1 检测实体肿瘤组织的微血管密度(MVD)

这是当前评价肿瘤内新生血管的常用指标，与患者的预后直接相关。王芳等[17]研究认为，MVD是评价肿瘤血管生成的金标准。很多对肺癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤微血管密度的研究文献报道，证实MVD是一个重要而独立的影响预后的指标[18]。刘本春等[19]在检测不同临床分期RCC的微血管密度中发现，肿瘤的恶性程度与微血管密度呈正相关，而且MVD可用来判断肾细胞癌的转移情况。

手术后取组织标本后首先在常规镜下观察肿瘤血管的形态结构情况，然后进行免疫组织化学染色来计数肿瘤内的MVD。多采用抗Ⅷ因子、抗CD31、CD34、CD105等单克隆抗体进行免疫组化染色。任方远等[20]报道通过Ⅷ因子相关抗原标记肾细胞癌和良性肾肿瘤的血管内皮细胞检测MVD，发现肾癌组织的MVD明显高于良性肾肿瘤，贾瑞鹏等[21]通过Ⅷ因子相关抗原标记不同临床分期肾癌组织中的MVD，发现肿瘤恶性程度越高，MVD的数值也越高。但Ⅷ抗原在淋巴管内皮细胞也可表达，标记的MVD特异性和敏感性欠佳。肾癌组织中用抗CD34单克隆抗体检测的MVD比用Ⅷ因子相关抗原抗体检测的MVD高20%～30%[22]，但由于抗CD34单克隆抗体在大血管内皮细胞和毛细血管内皮细胞都可表达，检查结果会出现假阳性。由此可见，选择针对肿瘤新生血管内皮细胞的标志物，对检测肿瘤的MVD尤为重要。抗CD105抗体在大血管不染色，正常组织中不表达，在肿瘤组织边缘染色明显，说明抗CD105抗体能更好的结合肿瘤新生血管的内皮细胞，具有较高特异性。在肾癌中用抗CD105抗体免疫组化染色能更敏感，对不成熟的微血管显示更好，以其计数MVD能更好反映肾癌的新生血管情况。

2.2 检测肿瘤血管形成的生长因子及相关因子的表达

多数学者认为肿瘤血管的生成有赖于肿瘤细胞内肿瘤血管生成因子(tumor angiogenesis factor，TAF)的表达。这些因子可诱导或是抑制血管的生成，肿瘤内可能同时存在一些诱导和抑制血管生成的因子，这些因子的表达失衡，启动了肿瘤新生血管。在肿瘤血管生成过程中至少有15种不同的血管生长因子过度表达，这些蛋白质多具有促血管生成的特性。其中研究较多的是血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。实验证明，VEGF是一种特异性最高、促肿瘤血管生长作用最强的因子[23]，同时是现阶段血管生成研究中最常用的指标[24]，肾细胞癌组织中VEGF的表达远高于肾良性肿瘤，且与MVD呈正相关，提示VEGF与RCC的血管生成密切相关。其他肿瘤血管形成生长因子还有血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、肿瘤坏死因子(TNFα)、类表皮生长因子域7(EGFL7)等。肾细胞癌中EGFL7的表达程度和微血管密度与肿瘤病理分级和临床分期有相关性，EGFL7在肾癌浸润转移中起重要作用[25]。

综上所述，手术前的各种评价肾细胞癌新生血管的方法对肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、制定手术方案及估测疗效有非常重要的临床意义；手术后微血管密度检测可用来评估RCC的恶性程度、转移和预后。对肿瘤新生血管形成生长因子及相关因子表达的研究发现，一些因子可以作为评判肿瘤浸润和转移的指标，有些因子则可能成为肾癌治疗的新靶点，为肾癌的生物学治疗和基因治疗提供新思路。

近年来，微血管定量成为研究焦点，在上述RCC新生血管的评估方法中能够定量分析的方法包括：作为评估金标准的微血管密度检测，定量检测肿瘤新生血管生长因子和相关因子的表达，应用超声新技术定量或半定量肿瘤内新生血管。超声具有血流检出率高、无创伤、可重复性等优点，可作为评价肾癌新生血管的首选方法。进一步研究超声定量血管的方法和微血管定量及血管生成因子及相关因子之间的相关性，尤其若能使用超声新技术SMI来定量分析肾细胞癌新生血管，将是未来的发展方向。

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266042 山东 青岛， 青岛市中心医院 泌尿外科(崔 涛)；266042 山东 青岛，青岛市肿瘤医院

腹部超声科(葛明珠)；054500 河北 平乡，河北省平乡县人民医院 功能科(张志峰)

崔 涛，男，主治医师，研究方向：泌尿外科学，E-mail:1138097751@qq.com

崔 涛，E-mail:1138097751@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.016

1674-4136(2016)01-0054-04

2015-07-06][本文编辑：李筱蕾]