高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

王 卓， 井昶雯， 吴建中， 马 蓉

临床与基础研究

高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

王 卓， 井昶雯， 吴建中， 马 蓉

目的 利用高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting，HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变，分析两者之间的关系，并探讨其临床应用价值。方法 利用HRM技术检测EGFR基因突变的方法，检测200例非小细胞肺癌患者石蜡包埋标本和200例相应的血清游离DNA，并将二者结果进行比较分析。结果 HRM法检测非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%，血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25.0%，HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比，敏感性为57.5%，特异性为100%。结论 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会。

高分辨率熔解曲线分析技术； EGFR基因突变； 血清游离DNA

肺癌是全球导致死亡的主要恶性肿瘤之一，现已成为我国首位恶性肿瘤死亡原因。其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%左右[1]。临床上大部分NSCLC患者首诊时已处于中、晚期，大都失去了手术治疗的机会，通常釆用放、化疗治疗手段，但治疗效果往往并不理想。分子靶向治疗是近些年来NSCLC治疗的重大进展。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 突变在NSCLC分子靶向治疗中的作用也越来越受到人们的重视。EGFR 突变是NSCLC患者是否对分子靶向治疗酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)敏感的强预测因子[2]。因此，EGFR 基因突变的检测能为NSCLC分子靶向治疗提供重要依据。本研究采用高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting，HRM)分别对NSCLC患者石蜡包埋组织和血清游离DNA进行EGFR 基因突变的检测，检测EGFR 基因18～21外显子突变。分析两者之间的关系，并探讨其临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 标本来源 标本采自2012年1月至2014年12月我院收治的NSCLC患者石蜡包埋组织200例及相对应的血清标本200例。用DNA FFPE tissue kit (Qiagen)提取试剂盒提取石蜡组织DNA，并保存于-20 ℃备用。用DNA Blood mini kit(Qiagen)提取试剂盒提取血清游离DNA，也保存于-20 ℃备用。

1.2 实验方法 设计适用于HRM技术的引物[3]，引物如表1所示。

表1 HRM法引物

HRM反应体系与反应条件：HRM检测采用Roche LightCycler 480 system。反应体系为LightCycler HRM Master Reaction Mix (Roche), 3 mM MgCl2, and 200 nM primers和DNA模板，总体积为20 μl。扩增反应条件为：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72℃延伸20 s，45个循环(采用touchdown技术，前10个循环退火温度从65 ℃降到55 ℃，每个循环降1 ℃)。扩增结束后直接进行HRM分析，反应条件为95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲线数据收集从70～95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s。40 ℃冷却[4]。

2 结果

2.1 HRM法检测NSCLC患者石蜡包埋组织和血清游离DNA的EGFR基因突变结果统计与分析 检测结果显示HRM法检测NSCLC患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%，18～21外显子突变的检出例数分别为4、38、3和42例。

而血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25%，18～21外显子突变的检出例数分别为2、22、2和24例。血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率低于石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率。具体结果如表2所示。

图1～图4为HRM法检测EGFR基因突变实验中选取的18、19、20和21外显子的突变示意图。

表2 HRM法检测NSCLC患者石蜡包埋组织和

2.2 血清游离DNA的EGFR基因突变检测的特异性和敏感性 以HRM法检测NSCLC患者石蜡包埋组织DNA的结果为参照，HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变的敏感性与特异性结果如表3所示。

表3 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因

HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比，敏感性为57.5%，敏感性一般，特异性为100%，特异性很好。

3 讨论

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白，属于HER家族中的一员。其主要分布在细胞膜的表面，结构由三部分组成：细胞外配体结合域、跨膜区与细胞内酪氨酸激酶域[5]。有资料表明EGFR基因是肺癌生长的重要调控基因[6]。EGFR突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子[2]。因此，EGFR 基因突变的检测能为肿瘤患者尤其是非小细胞肺癌患者分子靶向治疗提供重要依据。

目前，临床上EGFR基因突变的检测多是采用测序法和ARMS法。测序法相对而言过程繁琐复杂、耗时长，并且对取材和操作技术要求比较高，更重要的是由于测序方法本身的灵敏度不高，原则上只能对含量大于30%的突变基因进行检测，很多穿刺、石蜡等标本的检测受限制。ARMS法简便，灵敏度高，但价格昂贵，且只能检测已知突变，无法检测未知突变。本实验采用的HRM法灵敏度较高，研究报道其灵敏度可达5%肿瘤细胞突变[3]，其价格便宜，操作简便，检出率较传统方法高。

现有的EGFR基因突变检测的标本来源基本上是手术切除或穿刺活检的肿瘤组织，属于有创检查。但是在实际临床诊断和治疗过程中，有相当一部分的患者已失去了手术或穿刺活检获取肿瘤组织的机会。因此近年来有学者提出了无创检查——血清游离DNA的EGFR基因突变检测[7-9]。

血清游离DNA的EGFR基因突变检测的关键问题是血清游离DNA的富集提取以及高灵敏度的检测方法。本实验采用了均一性和重复性较好的DNA Blood mini kit(Qiagen)提取试剂盒富集提取血清游离DNA，并采用了高灵敏度的HRM法。结果显示，血清游离DNA进行EGFR基因突变检测检出率只有25%，低于石蜡包埋组织DNA基因突变检出率的43.5%，敏感性只有57.5%，检出率和敏感性有待提高。我们推断这可能是由于本身血清游离DNA含量就少，此次试验富集提取的方法仍然有局限，提取的DNA含量有限，从而对后续的检测产生了影响，导致检出率和敏感性不高。但考虑到为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会，且检测无创、价格便宜、操作简便，因而此方法仍具有一定临床应用价值。相信随着技术的发展，血清游离DNA富集提取方法的改进，EGFR基因突变检测的检出率和敏感性得到提高，HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变终能得到广泛应用并造福于广大患者。

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[4] 王卓，井昶雯，曹海霞，等.高分辨率熔解曲线分析技术检测EGFR基因突变方法的建立及其初步临床应用[J].中国肿瘤外科杂志,2014,6(4):236-239.

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High resolution melting analysis for EGFR mutations in plasma free DNA

WANGZhuo,JINGChangwen,WUJianzhong,MARong.

(ExperimentCenterofClinicalOncology,JiangsuCancerHospical,Nanjing210009,China)

Corresponding author:MARong,E-mail：965092958@qq.com

Objective To detect EGFR mutations using FFPE tissues and plasma free DNA by HRM analysis and to evaluate its clinical application value. Methods Formalin-fixed paraffin-embedded tissues and plasma free DNA of 200 NSCLC patients were detected by HRM analysis, the results were analyzed and compared accordingly. Results For FFPE tissues, the total EGFR mutation rate was 43.5% detected by HRM, and for plasma free DNA, the EGFR mutation rate was 25.0%. The sensitivity of HRM assays in plasma free DNA samples was 57.5%, the specificity of HRM assays in plasma free DNA samples was 100%. Conclusions HRM for EGFR mutations in plasma free DNA could be accepted as an option for patients who are unable to obtain tumor tissue specimens in the diagnostic or screening setting.

High resolution melting analysis; EGFR mutation; Plasma free DNA

江苏省肿瘤医院院内基金(ZQ201205，ZQ201206，ZM201203)

210009 江苏 南京，江苏省肿瘤医院 临床肿瘤实验中心

王 卓，男，助理研究员，研究方向：分子生物学，E-mail：wangzhuo14@sohu.com

井昶雯，女，实习研究员，研究方向：分子生物学，E-mail：jcw223200@163.com

马 蓉，女，副研究员，研究方向：肿瘤的基础研究，E-mail：965092958@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.011

1674-4136(2016)01-0036-04

2015-10-19][本文编辑：文 心]