卵巢癌患者肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤活性观察

马丹宇，张维维，刘国炳，邓欢，梁卫江( 南方医科大学南方医院，广州5055;南方医科大学第三附属医院)

卵巢癌患者肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤活性观察

马丹宇1，张维维1，刘国炳1，邓欢2，梁卫江1
( 1南方医科大学南方医院，广州510515;2南方医科大学第三附属医院)

摘要:目的观察卵巢癌( OC)患者肿瘤浸润淋巴细胞( TILs)的抗肿瘤活性。方法采用联合酶消化分离并提纯OC组织中的TILs和OC细胞，以IL-2体外诱导活化扩增TILs。活化前及活化第14天，采用流式细胞仪检测TILs免疫表型() ;活化前及活化第3、7、14天，采用MTT法检测TILs对自体OC细胞、人白血病细胞株K562、人B细胞淋巴瘤细胞株Raji的杀伤活力;收集经活化第14天TILs作用前后的OC细胞培养上清液，ELISA法检测肿瘤分子标志物CA-125、CA-153、血管内皮生长因子( VEGF)、基质金属蛋白酶9( MMP-9)。结果与活化前比较，活化第14天TILs中细胞比例增加细胞比值降低;随着活化时间延长，TILs对三种靶细胞的杀伤率增高( P均＜0.05)，且对OC细胞的杀伤率高于其余2种细胞( P均＜0.05) ;与处理前相比较，活化第14天TILs作用的OC细胞培养上清液中CA-125、VEGF、MMP-9水平均显著降低( P均＜0.05)。结论卵巢癌患者的TILs具有抗肿瘤活性，低浓度IL-2可增强其特异性和非特异性抗瘤活性。

关键词:卵巢癌;肿瘤浸润淋巴细胞;免疫表型;血管内皮生长因子;基质金属蛋白酶

Antitumor activity of tumor-infiltrating lymphocytes in patients with ovarian cancer

MA Dan-yu1，ZHANG Wei-wei，LIU Guo-bing，DENG Huan，LIANG Wei-jiang
( 1Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

Abstract:Objective To observe the antitumor effect of tumor-infiltrating lymphocytes ( TILs) in patients with ovarian cancer ( OC).Methods The TILs and autologous OC cells were isolated and purified from OC tissues by using joint enzyme digestion method，then the TILs were activated and amplified in vitro by IL-2.The immunophenotypes (，) of TILs were tested by flow cytometry before the activation and the 14th day of activation; the Methyl Thiazolyl Tetrazolium ( MTT) was used to detect the cytotoxic effects of the TILs on autologous OC cells，human leukemia cell line K562 and human B lymphoma cell line Raji before activation and on the 3th，7th and 14th day of activation; the culture supernatant of ovarian cancer was collected before and after the autologous OC cells were killed by TILs on 14th day，then，the tumor molecular markers CA-125，CA-153，vascular endothelial growth factor ( VEGF) and matrix metalloproteinase 9 ( MMP-9) of culture supernatant were detected by using the enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA).Results Compared with before activation，the proportions oof TILs were significant increased on the 14th day of activation，while theratio was significant decreased.With the prolonged activation time，the cytotoxic effects of TILs on the three kinds of target cells were significantly increased ( all P＜0.05)，and the killing rate of OC cells was higher than the rest of two kinds of cells ( all P＜0.05).Compared with before treatment，the CA-125，VEGF and MMP-9 of autologous OC in the culture supernatant were significantly decreased on the 14th day of activation ( all P＜0.05).Conclusion The TILs from OC tissues have antitumor activity，and the specificity and non-specificity cytotoxic function of TILs can be effectively activated and amplified by low concentration of IL-2.

Key words:ovarian carcinoma; tumor-infiltrating lymphocytes; immunophenotype; carbohydrate antigen; vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase

卵巢癌( OC)发病隐匿、肿瘤异质性高、转移率高，是女性生殖道恶性肿瘤的主要死亡原因［1］。目前，免疫治疗已成为除手术、化疗、放疗外的一种有效治疗方法。肿瘤浸润淋巴细胞( TILs)是从肿瘤组织中分离的一群富含肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的致敏淋巴细胞群体，对自体和异体肿瘤细胞均具有较强的杀伤活性，其抗肿瘤活性比淋巴因子激活的杀伤细胞高50～100倍［2］。研究发现，TILs治疗恶性黑色素瘤、肾癌等均疗效显著［3～8］，但TILs 在OC治疗中的作用尚处于初期研究阶段。为此，我们于2012年4月～2013年3月对OC患者的TILs进行分离、活化，观察其抗肿瘤活性。

1　材料与方法

1.1材料收集同期于南方医院行肿瘤细胞减灭术治疗的初治OC患者的OC组织标本12例份，患者年龄38～65岁，均术后病理学检查确诊;人白血病细胞株K562、人B细胞淋巴瘤细胞株Raji，均由南方医科大学南方医院血液科实验室提供;人淋巴细胞分离液( 100% Ficoll-Hypaque)购自天津市灏洋生物制品有限公司;Ⅱ型胶原酶购自Invitrogen公司;透明质酸酶和DNA酶购自Sigma公司;白细胞介素-2( IL-2)购自北京双鹭药业股份有限公司;荧光标记单克隆抗体购自美国BD公司; ELISA试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。

1.2自体OC细胞与TILs获取将OC组织标本剪碎，采用联合消化法［9，10］分离获得自体OC细胞及TILs。

1.3细胞培养与TILs活化K562、Raji细胞均使用10%FBS RPMI-1640完全培养基培养，根据细胞生长情况换液、传代培养;自体OC细胞及TILs分别用含20%和10%胎牛血清( FBS)的RPMI-1640完全培养液培养。在TILs培养液中加入2 500 U/mL 的IL-2，使TILs活化、扩增，每1～2 d补充IL-2 1次，共活化14 d。

1.4 TILs活化前后免疫表型观察活化前、活化第14天时，采用流式细胞术检测TILs免疫表型，包括T淋巴细胞。

1.5 TILs对肿瘤细胞的杀伤作用观察分别取细胞密度为1×105/mL的3种细胞80 μL接种于96孔板中，每组设置3个复孔，置于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。取活化前及活化第3、7、14天的TILs细胞，按照效靶比( E∶T) 50∶1分别与3种细胞共培养12 h。采用MTT法测定各孔570 nm处的光密度OD值，计算TILs对肿瘤细胞的杀伤率。杀伤率=［1－( ODE + T－ODE)/ODT］，其中ODE + T为TILs混合靶细胞的OD值，ODT为单纯靶细胞孔处OD值。

1.6 TILs作用前后OC细胞上清液肿瘤分子标志物检测收集活化前及活化第14天TILs作用的OC细胞培养上清液，ELISA法检测肿瘤分子标志物CA-125、CA-153、血管内皮生长因子( VEGF)、基质金属蛋白酶9( MMP-9)。

1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，采用单因素方差分析、独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 TILs活化前后免疫表型变化见表1。

表1　 TILs活化前后免疫表型变化( n =12，±s)

表1　 TILs活化前后免疫表型变化( n =12，±s)

注:与活化前比较，*P＜0.01。

活化时间　CD+3( %)　 CD+4( %)　 CD+8( %)　 CD+4/CD+8活化前48.2±14.5　 20.4±16.7　 21.7±11.9　 1.5±1.7活化第14天　69.6±10.7*25.6±16.0　 37.0±10.5*0.8±0.8

2.2不同活化时间TILs对3种肿瘤细胞的杀伤率比较见表2。

2.3 TILs作用前后OC细胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比较见表3。

表3　 TILs作用前后OC细胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比较( n =12，±s)

表3　 TILs作用前后OC细胞上清液CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9水平比较( n =12，±s)

注:与作用前比较，*P＜0.01。

作用时间　CA-125 ( U/mL) CA-153 ( pg/mL) VEGF ( pg/mL) MMP-9 ( pg/mL)作用前　1 051.4±583.8 115.1±48.9 1 480.0±520.0 1 732.1±560.8作用第14天　240.2±195.7*93.1±50.9　 697.6±273.7*865.7±435.9*

3　讨论

TILs是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，主要包含、T淋巴细胞及NK细胞和LAK细胞等，是近年来肿瘤免疫治疗的研究热点。和T淋巴细胞均对肿瘤细胞具有特异性杀伤活性，而NK 和LAK细胞均具有非特异性杀伤活性。目前，常用的淋巴细胞活化生物制剂包括CD3单抗和IL-2。IL-2属于淋巴细胞活化因子，主要由和

T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，可以活化所有T淋巴细胞。新鲜制备的原位TILs 以T细胞为主，主要为具有细胞毒性功能的T淋巴细胞和具有免疫调节功能的T淋巴细胞。研究发现，除黑色素瘤和头颈部肿瘤外，大部分肿瘤中的TILs明显多于TILs。大量T细胞以及Treg等抑制性T淋巴细胞的存在可导致肿瘤组织内的TILs抗瘤活性低下，进而引起肿瘤细胞发生免疫逃逸，有利于肿瘤的发生、发展。此外，未成熟树突状细胞分泌的吲哚双氧化酶、精氨酸酶以及肿瘤微环境中的骨髓来源抑制细胞也可抑制TILs的活化［11］。本研究结果显示，OC组织中初分离的TILs尚处于抑制状态，经IL-2诱导活化、扩增后，TILs细胞明显增多，比TILs增多更为明显，前者发挥着主导地位，提示TILs细胞在OC的杀瘤机制中起主要作用。

研究发现，从免疫抑制的肿瘤微环境中分离出的TILs，在经体外活化扩增后可以明显增强其对肿瘤细胞及支持肿瘤细胞生长的血管内皮细胞的特异性杀伤力［12］。因此，通过分离活化扩增肿瘤组织内的具有杀瘤活性的TILs，然后再回输至患者体内可以特异性的杀伤肿瘤，从而提高患者生存率。尽管如此，但TILs的个体化差异很大，每例肿瘤组织内提取的TILs对肿瘤的特异性反应也不一致。目前研究表明，除黑素瘤TILs具有较强的自身肿瘤特异性杀伤作用以外，其他肿瘤来源的TILs未表现出明显地抗自身肿瘤的特异性。本研究发现，活化前的TILs对3种肿瘤细胞都表现出较低的杀伤力，但是IL-2诱导活化扩增后的，TILs具有良好的特异性抗瘤活性;活化第14天的TILs与OC组共培养后，上清液中CA-125、VEGF、MMP-9下降明显，提示TILs通过对OC细胞的杀伤作用从而使OC细胞分泌肿瘤标志物及腹水形成因子的能力明显下降。TILs在过继性治疗肿瘤中的作用机制，主要与其中的细胞毒性T淋巴细胞有关;此外，也有研究表明激活的T淋巴细胞还可表达膜凋亡配体Fasl，通过与肿瘤细胞表达的Fas受体结合，从而导致肿瘤细胞发生凋亡［13］。尽管TILs细胞具有较强的抗瘤活性，但从肿瘤组织中高效分离出TILs以及将TILs活化扩增至理想治疗量仍缺乏快速、有效的方法。OC组织松脆，细胞易分离。本研究采用联合消化法分离获得TILs细胞，在体外活化扩增14 d后即可达临床有效治疗剂量，较既往研究报道的培养时间( 4周)更快［14］。

综上所述，OC来源的TILs具有抗肿瘤活性;低浓度IL-2可活化扩增TILs并增强其特异性和非特异性抗瘤活性。

参考文献:

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收稿日期:( 2015-04-03)

通信作者简介:梁卫江( 1963-)，女，主任医师，教授，研究方向为妇科肿瘤的临床诊治及应用基础。E-mail: wjliang22@126.com

作者简介:第一马丹宇( 1986-)，女，硕士，研究方向为妇科恶性肿瘤的基础和临床。E-mail: madanyu86@126.com

基金项目:广东省科技计划资助项目( 2011B031800042)。

文章编号:1002-266X( 2015) 30-0011-03

文献标志码:A

中图分类号:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.004