阿托伐他汀对冠脉痉挛大鼠心肌超微结构及RhoA活性的影响

苏林博 谢莲娜 王凯君 王丽君 党凤强 张一凡

基础研究

阿托伐他汀对冠脉痉挛大鼠心肌超微结构及RhoA活性的影响

苏林博 谢莲娜 王凯君 王丽君 党凤强 张一凡

目的 探讨阿托伐他汀预处理对垂体后叶素致冠状动脉痉挛大鼠心肌超微结构及冠状动脉RhoA活性的影响。方法 50只SD大鼠随机分为5组，正常组（无特殊处理）、对照组（生理盐水）、阿托伐他汀组（5 mg·kg-1·d-1）、硝苯地平组（5 mg·kg-1·d-1）和联合用药组（阿托伐他汀 5 mg·kg-1·d-1+硝苯地平5 mg·kg-1·d-1）。除正常组外，其余四组连续灌胃15 d后，经鼠尾静脉注入垂体后叶素1.5 U/kg，诱发冠状动脉痉挛。应用透射电镜观察大鼠心肌细胞超微结构变化；应用Western Blot方法测定大鼠冠状动脉细胞膜RhoA蛋白表达水平和细胞浆RhoA蛋白表达水平，以细胞膜RhoA与细胞浆RhoA比值表示RhoA活性，比较各组大鼠冠状动脉RhoA活性。结果 ①心肌细胞超微结构：对照组心肌细胞超微结构明显破坏；硝苯地平组及阿托伐他汀组大鼠心肌细胞超微结构的破坏程度较对照组明显减轻；联合用药组大鼠心肌细胞超微结构没有明显破坏。②冠状动脉RhoA活性：与正常组相比，对照组冠状动脉RhoA活性明显升高（2.55±0.15比 0.81±0.16，P＜0.01）；与对照组相比，阿托伐他汀组冠状动脉 RhoA 活性明显减低（0.99±0.34比 2.55±0.15，P＜0.01），硝苯地平组冠状动脉 RhoA 活性未见明显改变（2.21±0.23比 2.55±0.15，P=0.08），联合用药组冠状动脉RhoA活性明显减低（1.13±0.42比2.55±0.15，P＜0.01）。结论 阿托伐他汀预处理能有效预防垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛，保护心肌细胞，与硝苯地平联合应用具有协同作用。抑制RhoA/Rho激酶信号通路的活性参与阿托伐他汀预防冠状动脉痉挛，保护心肌细胞。

阿托伐他汀； 冠脉痉挛； RhoA活性

阿托伐他汀是强有效的降胆固醇药物，在临床上广泛应用于冠心病的一级和二级预防[1]。近来他汀类药物独立于降脂作用的心血管益处（多效性）被广泛关注[2,3]，包括抑制血管平滑肌增生、改善内皮功能障碍、减少血小板聚集和稳定动脉粥样硬化斑块等[4]。既往研究[5]表明，他汀类药物的多效性是通过抑制RhoA/Rho激酶信号传导通路。体外及临床研究[6,7]表明，他汀类药物有预防冠脉痉挛的作用。但有关他汀预防冠脉痉挛的机制尚不清楚。本实验通过垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛，探讨阿托伐他汀预处理能否预防冠状动脉痉挛造成的心肌损害，以及对大鼠冠状动脉RhoA活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 阿托伐他汀（辉瑞公司）；垂体后叶素（上海第一生化药业有限公司）；硝苯地平（山西云鹏制药有限公司）；水合氯醛（上海生工）；一抗为兔抗大鼠多克隆RhoA抗体（1∶200，santa cruz，美国）；GAPDH（1∶750，Bioworld，美国）；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1000，Thermo Fisher Scientific，美国），膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒（凯基生物，中国）；Braford蛋白含量检测试剂盒（凯基生物，中国）；ECL化学发光检测试剂盒（凯基生物，中国）；Western电泳及转膜装置（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像系统（Gene公司，英国）；JEM-2000EX透射电镜（JEOL公司，日本）

1.2 实验动物及分组 9～10周健康雄性SD大鼠50只，体重300～350 g，由大连医科大学实验动物中心提供。随机分为5组，每组10只。①正常组：不给予药物干预。②对照组：生理盐水每日灌胃1次。③阿托伐他汀组：5 mg/kg，每日灌胃1次。④硝苯地平组：5 mg/kg，每日灌胃1次。⑤联合用药组：阿托伐他汀5 mg/kg+硝苯地平5 mg/kg，每日灌胃1次。20 mg阿托伐他汀（10 mg/片）磨成粉末状，10 ml生理盐水中混匀。20 mg硝苯地平（10 mg/片）磨成粉末状，10 ml生理盐水中混匀。每日上午8～10点给药，持续15 d。

1.3 冠状动脉痉挛诱发实验 除正常组外，其余四组（对照组、阿托伐他汀组、硝苯地平组及联合用药组）连续灌胃15 d后均给予垂体后叶素诱发冠状动脉痉挛。步骤如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300～350 mg/kg），大鼠麻醉后仰位固定于鼠板，于鼠尾静脉注射垂体后叶素1.5 U/kg（10 s内推完），诱发冠状动脉痉挛。30 min后，剖胸，取冠状动脉装于冷冻管中，-80℃冰箱冷冻保存，用于免疫印迹（Western blot）检测；取心尖部组织，在2.5%戊二醛中切成约1 mm3的小块，放置于2.5%戊二醛中4℃保存。

1.4 超微结构观察 2.5%戊二醛固定大鼠心尖部心肌组织，常规电镜样品包埋，超薄切片，铀、铅双重染色，透射电镜观察超微结构变化并摄影。

1.5 RhoA活性测定 用Western Blot测定大鼠冠状动脉细胞膜RhoA与细胞浆RhoA的蛋白表达水平，以细胞膜RhoA蛋白表达水平与细胞浆RhoA蛋白表达水平的比值表示RhoA活性。一抗：兔抗大鼠多克隆RhoA抗体，稀释浓度为1∶200。二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG，稀释浓度为1∶1000。内参：GAPDH，稀释浓度为1∶750。根据膜蛋白胞浆蛋白提取试剂盒说明书，分别提取胞浆蛋白和胞膜蛋白。采取Bradford法进行蛋白定量，等量样品经12%SDS-PAGE分离后，湿转法电转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶中4℃封闭过夜，分别加入兔抗大鼠RhoA多克隆抗体和兔抗大鼠 GAPDH抗体，室温摇床孵育3 h。膜漂洗后，加入HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，酶法显色，扫描。采用 Image J图像分析系统分析细胞膜RhoA和细胞浆RhoA灰度值，选取3次独立的实验结果进行统计学分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌细胞超微结构变化 正常组：肌丝排列整齐，形态完好，肌节结构完好；肌丝间线粒体排列整齐，形态正常，界膜完整，嵴无断裂。对照组：心肌超微结构破坏明显，肌丝排列紊乱，肌节消失；肌丝间线粒体成堆聚集、肿胀；大部分线粒体局部膜破裂，嵴降解。硝苯地平组：较对照组明显好转，肌丝排列不规则，肌节结构完好；部分线粒体增生、肿大，形态有变形，但界膜完整，嵴清晰。 阿托伐他汀组：较对照组明显好转，肌丝排列不规则，肌节结构完好；线粒体有小部分融合，余形态正常，嵴清晰。联合用药组：心肌超微结构接近正常，未见明确形态学改变。见图1。

2.2 各组大鼠冠状动脉RhoA活性的改变 与正常组比较，对照组大鼠冠状动脉RhoA活性明显升高（2.55±0.15 比 0.81±0.16，P＜0.01）。与对照组比较，硝苯地平组大鼠冠状动脉RhoA活性未见明显改变（2.21±0.23 比 2.55±0.15，P=0.08）；阿托伐他汀组大鼠冠状动脉RhoA活性明显减低（0.99±0.34比2.55±0.15，P＜0.01）；联合用药组大鼠冠状动脉RhoA 活性明显减低（1.13±0.42比 2.55±0.15，P＜0.01）。见图 2。

3 讨论

本实验结果显示，鼠尾静脉注射垂体后叶素能诱发冠状动脉痉挛，导致心肌细胞超微结构破坏伴有血管平滑肌细胞RhoA激活。阿托伐他汀预处理能有效保护心肌细胞的超微结构，预防RhoA激活。

静脉注射垂体后叶素是诱导大鼠急性心肌缺血常用的经典模型[8]。本实验的前期研究证实，垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛引起缺血性心电图改变[9]。垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛，造成心肌急性缺血缺氧损伤。心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标。线粒体是维持细胞氧及能量代谢等的重要功能单位，故对缺氧十分敏感，是反映心肌细胞损伤的敏感指标[10]。本实验通过鼠尾静脉注射垂体后叶素诱发冠状动脉痉挛，电镜下可见心肌超微结构破坏明显，肌丝排列紊乱，肌节消失；肌丝间线粒体成堆聚集、肿胀；大部分线粒体局部膜破裂，嵴降解，与既往研究结果一致[11]。预防性应用阿托伐他汀能明显减轻大鼠心肌细胞超微结构的破坏：肌丝排列好转，肌节结构完好，线粒体仅有小部分融合，嵴清晰，与传统预防冠脉痉挛的钙通道阻滞剂硝苯地平作用效果相似，提示阿托伐他汀和硝苯地平一样能有效预防冠状动脉痉挛、保护心肌细胞。阿托伐他汀和硝苯地平联合应用效果优于两药单独应用，能更好地预防垂体后叶素诱发冠状动脉痉挛所致大鼠心肌细胞超微结构破坏，提示阿托伐他汀和硝苯地平通过不同途径预防冠状动脉痉挛，两者联合应用具有协同作用。

血管平滑肌收缩增强是冠状动脉痉挛的主要发病机制之一[12]。血管平滑肌细胞的收缩由细胞内钙离子浓度及收缩器对钙离子的敏感性调节。介导平滑肌细胞钙离子敏感性增加的主要是肌球蛋白轻链磷酸酯酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的抑制。RhoA/Rho激酶信号通路激活，通过磷酸化MLCP的肌球蛋白结合亚单位抑制MLCP活性增强血管平滑肌细胞对钙离子的敏感性，在冠脉痉挛的发病机制中起关键作用[13]。动物实验[14]及临床研究[15]均表明，冠状动脉痉挛时RhoA/Rho激酶信号通路活性增强。临床研究[16]表明，Rho激酶抑制剂能有效抑制冠状动脉痉挛。本实验通过垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛发现，与正常组大鼠相比，对照组大鼠冠状动脉RhoA活性明显升高，说明垂体后叶素诱发冠状动脉痉挛的同时伴有冠状动脉RhoA激活，提示血管平滑肌细胞RhoA/Rho激酶信号传导通路激活参与垂体后叶素诱发冠状动脉痉挛的发病机制。

胆固醇合成的中间产物类异戊二烯介质是小G蛋白家族包括RhoA激活的必要物质基础。这些类异戊二烯介质与RhoA的羧基末端相连，增加RhoA的亲脂性（异戊烯化），促使其定位在细胞膜上而激活，进而激活下游效应蛋白Rho激酶，发挥信号转导功能。阿托伐他汀抑制HMG-CoA还原酶在减少胆固醇合成的同时减少类异戊二烯介质的合成，抑制RhoA的异戊烯化[15]，从而抑制RhoA/Rho激酶信号传导通路的活性。Rattan的实验[17]发现，他汀通过抑制RhoA从胞浆转移到胞膜，进而抑制RhoA活性。本实验结果显示，垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛的同时伴有冠状动脉RhoA活性升高，阿托伐他汀组及联合用药组大鼠冠状动脉RhoA活性明显低于对照组大鼠，证实预防性应用阿托伐他汀能够抑制大鼠冠状动脉血管平滑肌细胞RhoA激活。既往动物实验及临床研究证实，他汀类药物具有预防冠状动脉痉挛的作用[6,7]。综上推测，抑制RhoA/Rho激酶信号传导通路活性和抑制冠状动脉血管平滑肌细胞的钙离子敏感性，是阿托伐他汀预防垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛、保护心肌细胞的重要机制。

冠状动脉痉挛是众多缺血性心脏病包括变异型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死及猝死的基本发病机制之一。钙通道阻滞剂是目前治疗冠状动脉痉挛基础用药及经典用药[18]。钙通道阻滞剂主要通过阻断钙离子内流、降低血管平滑肌细胞内钙离子水平，使冠状动脉扩张。然而，临床实践中40%的患者单用钙通道阻滞剂仍不能完全控制冠状动脉痉挛[19]。他汀类药物与钙通道阻滞剂联用通过不同途径降低冠状动脉平滑肌细胞的收缩性，具有更好的预防冠状动脉痉挛的作用，为防治临床冠状动脉痉挛提供更多的选择。

阿托伐他汀预处理能有效预防垂体后叶素诱发大鼠冠状动脉痉挛，保护心肌细胞，与硝苯地平联合应用具有协同作用；同时还具有抑制RhoA/Rho激酶信号通路的活性参与阿托伐他汀预防冠状动脉痉挛、保护心肌细胞的作用。

（本文图片封三）

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The effects of Atorvastatin on myocardial ultrastructure and RhoA activity in rats with coronary artery spasm

SU Lin-bo，XIE Lian-na，WANG Kai-jun，et al.Department of Circulation，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

Objective The present study was undertaken to investigate the protective effects and mechanisms of Atorvastatin on pituitrin-induced coronary artery spasm in rats.Methods Fifty male SD rats were randomly assigned to five groups（n=10）：normal group（no any intervention），control group（saline），Atorvastatin group （5 mg·kg-1·d-1），Nifedipine group （5 mg·kg-1·d-1） and combined group （Atorvastatin 5 mg·kg-1·d-1and Nifedipine 5 mg·kg-1·d-1）.After 15 days of treatment by intragastric administration （except the normal group），coronary artery spasm was induced by injecting pituitrin（1.5 U/kg）through caudal vein.The ultrastructure of myocardial tissue was observed by electron microscopy.The membrane RhoA protein expression and cytosolic RhoA protein expression of coronary artery tissue was detected by western blot，and RhoA activity was expressed as the ratio of membrane RhoA protein and cytosolic RhoA protein.Results ⑴Pituitrin-induced coronary artery spasm caused the acute myocardial ischemic/anoxic injury，which result in myocardial ultrastructure damage.Prophylactic use Atorvastatin had a protective role in coronary artery spasm induced myocardial ultrastructure damage，and combined with Nifedipine was more effective.⑵Compared with the normal group，coronary artery RhoA activity in the control group was significantly increased（2.55±0.15 vs 0.81±0.16，P＜0.01）.Compared with the control group，coronary artery RhoA activity was significantly decreased in the Atorvastatin group（0.99±0.34 vs 2.55±0.15，P＜0.01），no statistically difference in the Nifedipine group（2.21±0.23 vs 2.55±0.15，P=0.08），and significantly decreased in the combined group（1.13±0.42 vs 2.55±0.15，P＜0.01）.Conclusion Atorvastatin could effectively prevent pituitrin-induced coronary artery spasm，and had protective effect on myocardial ultrastructure in rats.The addition of Atorvastatin to Nifedipine had synergistic effect.Inhibition of RhoA/Rho-kinase pathway involve in the mechanism of Atorvastatin preventing coronary artery spasm.

Atorvastatin； Coronary artery spasm； RhoA activity

XIE Lian-na，E-mail：xieln1963@163.com

116001 辽宁省大连市，大连大学附属中山医院循环科

谢莲娜，E-mail：xieln1963@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．024

Q95-33；R541.4

A

1672-5301（2016）11-1052-04

2016-04-19）