青浦区266株结核分枝杆菌基因分型及其与耐药表型关系研究

青浦区266株结核分枝杆菌基因分型及其与耐药表型关系研究

彭荣，费凤英

(上海市青浦区中心医院检验科，上海 201700)

摘要：目的探讨上海市青浦区流行的结核分枝杆菌(MTB)的主要基因型及其与耐药表型的关系。方法分别提取266株MTB DNA，应用多重聚合酶链反应(PCR)对其进行分型(北京基因型/非北京基因型)鉴定；采用比例法对此266株菌株进行利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的药物敏感性试验；运用SPSS 17.0统计软件分析基因分型与患者性别、年龄的关系，以及基因分型与菌株耐药性之间的关系。结果266株菌株中北京基因型242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)。北京基因型菌株的总耐药率为23.96%，耐多药率为9.91%，非北京基因型的总耐药率和耐多药率分别为29.16%和8.33%，两者差异无统计学意义(P均>0.05)。结论北京基因型MTB可能是上海市青浦区的主要流行株，尚未发现北京基因型菌株和非北京基因型菌株在耐药方面有明显差异。

关键词：结核分枝杆菌；北京基因型；耐药

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)10-0983-04R378.91

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.004

Abstract:ObjectiveTo investigate the genotype and relationship of genotype with drug-resistant phenotypes of Mycobacterium tuberculosis(MTB)popular isolates in Qingpu, Shanghai. MethodsThe DNA of 266 MTB isolates were extracted and identified as Beijing genotype and non-Beijing genotype by multiplex polymerase chain reaction (PCR). Drug sensitivity tests of the 266 MTB isolates against streptomycin, isoniazid, rifampicin and ethambutol were performed by proportion method. The relationships of genotype with sex, age and drug-resistant phenotypes were analyzed by SPSS 17.0 statistical software, respectively. ResultsThe 242 isolates (90.98%) were identified as Beijing genotype, while 24 isolates (9.02%) were identified as non-Beijing genotype. The overall drug resistance rate of Beijing genotype isolates was 23.96%, while multidrug-resistance rate was 9.91%.The overall drug resistance rate and multidrug-resistance rate were 29.16% and 8.83% as to non-Beijing genotype. ConclusionsThe MTB popular isolates of Qingpu, Shanghai might be Beijing genotype, but it exists significant difference between Beijing and non-Beijing genotypes for drug resistance.

基金项目：上海市青浦区中心医院院级课题(QY2012-12)

作者简介：彭荣，女，1986年生，硕士，技师，主要从事结核病实验室诊断研究。

通讯作者：费凤英，联系电话：021-69719190-2509。

收稿日期：(2015-01-08)

Research on genotype and relationship of genotype with drug-resistant phenotypes from 266Mycobacteriumtuberculosisin Qingpu DistrictPENGRong,FEIFengying.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiQingpuDistrictCentralHospital,Shanghai201700,China)

Key words:Mycobacteriumtuberculosis; Beijing genotype; Drug resistance

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是引起结核病的病原菌，随着人类对基因研究的深入，人们对MTB的基因也有了新的认识。1995年中国、蒙古首次报道了MTB北京基因型家族[1]，该家族具有相同的基因标记，即IS6110限制片段长度多态性和间隔寡核苷酸分型的特征。北京基因型MTB作为世界范围内的第二大流行MTB，表现为毒力高、传播能力强、易突变的特点，能够逃脱卡介苗的免疫保护，并易产生耐药甚至耐多药[2]。西欧的研究结果表明，北京基因型家族株发生耐药的危险性比其它家族菌株增加约80%，并且与耐多药MTB明显相关[3]。同样在国内天津和江浙地区，北京基因型菌株在传播中占据主导地位，但具体的流行特征各不相同[4-5]。本研究旨在探讨上海市青浦区北京基因型及非北京基因型MTB的流行特征，分析基因型与耐药表型、患者性别和年龄的关系，以进一步获得北京基因型MTB的流行病学数据。

材料和方法

一、研究对象

研究所收集的266株MTB菌株来源于266例不同患者，其一般情况见表1。结合基因分型的结果可看出，北京基因型MTB感染者和非北京基因型MTB感染者在性别和年龄构成上差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　上海市青浦区2012至2013年度结核病患者基本信息　[例(%)]

二、菌株来源

上海市青浦区中心医院是青浦区唯一的结核病定点医院，收治了青浦区大多数的肺结核病患者。收集2011年12月至2013年12月该院收治的结核病患者痰和肺泡灌洗液样本中初次分离培养(排除非结核分枝杆菌以及1人多菌)的MTB临床分离菌株266株，H37Rv标准菌株由同济大学附属上海市肺科医院检验科惠赠。痰和肺泡灌洗液样本的收集、MTB的分离培养鉴定均参照《结核病诊断实验室检验规程》[6]进行。

三、药物敏感性试验

所有菌株参照《结核病诊断实验室检验规程》采用比例法[7-8]进行药物敏感性试验，采用的药物为常用的4种一线抗MTB药物，即链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇(上海抚生实业有限公司)。

四、细菌核酸的提取

将待检菌株转种于中性罗氏培养基(上海疾控生物有限公司)，37 ℃孵育4周，待形成菌落后取1接种环菌落，使用500 L含有吐温-80的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)(pH值7.8)充分分散，经80 ℃水浴，2 h灭活后使用快速细菌核酸提取试剂盒(Cat:N1152，广州东盛生物科技公司)提取核酸。

五、北京基因型和非北京基因型MTB的鉴定

1．引物设计本试验参照文献[4,9-10]采用经改进的多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定北京基因型及非北京基因型菌株。北京基因型菌株鉴定的上游引物为5′-ACAGGAAGCCGAATGAGGAC-3′，下游引物为5′-CGAAGGAGACCTCGTAGACAAG-3′(GenBank AF390039)；非北京基因型菌株鉴定的上游引物为5′-TGGGTCTGACGACTTGAACAC-3′，下游引物为5′-ACCTTCAGCACCACCATCATC-3′(GenBank BX842581)。扩增片段长度分别为261和491 bp。

2．PCR体系的建立采用15 μL体系，引物终浓度为0.2 μmol/L，DNA模板为10～20 ng，2×Master Mix 7.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。

3．多重PCR的建立提取H37Rv标准株、已确定的北京基因型MTB和临床分离株基因组作为模板，同时用北京基因型及非北京基因型菌株混合引物进行多重PCR扩增。为防止交叉污染，每次试验均设置无模板对照。

六、统计学方法

所有数据经SPSS 17.0软件统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、多重PCR鉴定

266株菌株中北京基因型MTB 242株(90.98%)，非北京基因型MTB 24株(9.02%)。见图1。

二、药物敏感性试验

242株北京基因型MTB中184株全敏感，58株耐药，其中耐多药菌株24株，耐链霉素菌株41株(包括耐多药菌株)，耐异烟肼菌株14株(包括耐多药菌株)，耐利福平菌株23株(包括耐多药菌株)，耐乙胺丁醇菌株14株(包括耐多药菌株)；24株非北京基因型MTB中17株全敏感，7株耐药，其中耐多药菌株2株。北京基因型菌株与非北京基因型菌株的分型在耐药表型方面差异无统计学意义(χ2=1.892，P>0.05)。见表2。

注：M为DNA marker；1为H37Rv标准株(非北京基因型菌株)扩增条带(491 bp)；2为已知北京基因型菌株扩增条带(约261 bp)； 3～24为临床分离株扩增条带(3、6、9、12、13、14和18为非北京基因型菌株；4、5、7、8、10、11、15～17和19～24为北京基因型菌株) 图1　多重PCR鉴定北京基因型MTB的琼脂糖电泳图

表2　上海市青浦区2012至2013年度北京基因型和非北京基因MTB的耐药情况　[例(%)]

讨论

中国范围内北京基因型MTB流行至少半个世纪[11]，但我们对北京基因型MTB的认识也仅十几年。在中国和周边的一些国家及地区，北京基因型菌株均占有较高的比例[12-14],甚至在遥远的南美，也有北京基因型菌株的报道[15]。在最新的意大利米兰的研究发现，北京基因型菌株所占的比例从1996年的1.7%上升到2009年的5.4%，并且大部分来源于拥有中国或前苏联国家血统的人，同时耐多药与北京基因型明显相关[16]。因此，北京基因型MTB何时出现并传播，怎样传播，与东南亚和前苏联人群有着怎样的关系；北京基因型MTB各亚型与耐药性有何关系，其耐药机制及其流行病学特点等许多问题尚需进一步阐明，以便为结核病的防治提供理论依据。

随着分子流行病学研究的深入，越来越多的方法被运用于MTB的基因分型，如间隔寡核甘酸分型方法、多重PCR以及数目可变的串联重复序列方法(variable number of tandem repeat，VNTR)[17]。本研究根据北京基因型菌株基因组中Rv2816和Rv2819序列缺失的特点，采用改进的多重PCR，使用普通PCR仪一步法鉴定北京基因型和非北京基因型MTB。此方法简单、易行、经济实用，在普通临床实验室即可开展，且有文献报道该方法与间隔寡核甘酸分型方法的结果一致率为100%[9]。

本研究是基于2012至2013年间，上海市青浦区中心医院收取的266株MTB，结果表明北京基因型MTB在该地区占主导地位，这与国内的研究[5-6]基本一致，但北京基因型与非北京基因型菌株的分型与耐药表型间尚无明显相关性，且未发现北京基因型和非北京基因型菌株之间在年龄、性别方面有明显差异，这与香港的研究相一致[18]。北京基因型与抗结核药物的耐药以及患者年龄无明显相关，而邻近的江浙地区研究表明感染北京基因型菌株的结核病患者发生耐异烟肼、耐利福平和耐多药结核病的危险性较大[6]。不同区域的研究结果不尽相同，可能是由于北京基因型菌株本身也有许多亚型，不同人群中北京基因型MTB亚型分布不同，其与耐药的关系也不同[19]。在越南的最新研究发现，北京基因型又分为典型和非典型2种亚型，典型菌株更容易发生异烟肼和链霉素的耐药[20]。因此，不同国家和地区人群中，耐药或耐多药结核病是否与北京基因型菌株所占的比例有关，以及是否与北京基因型亚型在这些人群中的分布情况有关，尚需要进一步研究证实。

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(本文编辑：姜敏)