大鼠动脉粥样硬化模型的建立

大鼠动脉粥样硬化模型的建立

邢玉桂，马飞，孙洪胜

(山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

摘要：目的建立一种操作容易、效果显著的大鼠动脉粥样硬化模型。方法8周龄Wistar大鼠分为高脂饲料组和基础饲料组，高脂饲料组大鼠给予按比例配制的高脂饲料，并辅以灌胃维生素D3，基础饲料组给予基础饲料，并灌胃生理盐水，喂养8周后观察大鼠血脂、血糖等生化指标、病理变化，并采用免疫组织化学法检测颈动脉中MMP-9的表达。结果经过8周高脂饲料喂养，高脂饲料组大鼠体重、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白等生化指标明显高于基础饲料组，尤其是甘油三酯和总胆固醇水平；高脂饲料组大鼠出现大量钙化斑块，高脂饲料组大鼠颈动脉MMP-9表达增多，基础饲料组无明显变化。结论按照7%猪油、5%胆固醇、3%白砂糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶、84.3%基础饲料的比例配置高脂高糖饲料喂养大鼠，并辅以700 000 U·kg-1的维生素D3进行灌胃，喂养8周可以成功建立大鼠动脉粥样硬化模型。

关键词：大鼠；动脉粥样硬化；生化检测；钙化斑块；基质金属蛋白酶-9

基金项目：山东省自然科学基金(No.ZR2010HL066)

作者简介：邢玉桂，女，副主任护师，研究方向：中药药理研究，E-mail：924164876@qq.com

通讯作者：孙洪胜，男，主任药师，硕士生导师，研究方向：中药新剂型新工艺研究，Tel：0531-82929059，E-mail：shs7777@163.com

中图分类号：R965文献标识码：A

Establishment of a rat model of atherosclerosis

XINGYu-gui,MAFei,SUNHong-sheng

(TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish the model of atherosclerosis with easy operation,obvious effect in rats.MethodsThe 8 weeks old Wistar rats were divided into the high fat diet group and the basic diet group.The high diet rats were feed with high fat food which was prepared accooding to a certain proportion and Vitamin D3 by gavage.The basic diet rats were given ordinary rat food and physiological saline by gavage.After they were feed 8 weeks,biochemical parameters such as blood glucose and blood lipid and pathological changes were observed,the expression of MMP-9 was observede by immunohistochemical method.ResultsAfter the rats were feed with high diet food 8 weeks,the weight,the blood glucose,triglyceride,total cholesterol,low density lipoprotein and other biochemical parameters of the high diet rats,especially triglyceride and the total cholesterol, were higher than the basic diet rats′.There was a lot of calcified plaque was found in the high fat diet rats′ carotid artery,the expression of MMP-9 in the high fat diet rats increase,but there was no significant change in the basic diet rats.ConclusionThe rats were feed with high fat food which include 7% lard oil,5% cholesterol,3%white sugar,0.5% sodium cholate,0.2% propyl sulphur pyrimidine,84.3% ordinary rat food,and 700 000 U·kg-1 Vitamin D3 by gavage.After 8 weeks,ideal rat model for the study of atherosclerosis can be established successfully.

Key words:Rat;Atherosclerosis;Biochemical assays;Calcified plaque;MMP-9

动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是受累动脉从内膜开始病变的一种常见血管病，它是引起心脑血管疾病的主要原因，严重危害人类身体健康。动脉粥样性血管疾病(ASVD)已成为全球首位死亡原因[1]。动脉粥样硬化的发病机制复杂，病变过程中伴随着脂质浸润、钙质沉着、炎症反应等[2]，各种学说都在一定程度上解释了动脉粥样硬化的发生、发展，但它们未能全面地解释动脉粥样硬化的发病机制。在动脉粥样硬化发病机制的研究中，合适的动物模型发挥了重要作用。因此，为了加深对动脉粥样硬化发病机制的研究，建立一种饲养方便、成活率高、操作容易的大鼠动脉粥样硬化模型具有重要意义。本实验以一定比例的高脂饲料，辅以灌胃维生素D3喂养大鼠，成功建立一种大鼠动脉粥样硬化模型，为以后动脉粥样硬化发病机制的进一步研究创造了条件。

1实验材料

1.1实验动物及试剂

1.1.1实验动物健康雄性Wistar大鼠，SPF级，6～8周龄，重量(180±20) g，山东鲁抗医药股份有限公司提供(许可证号：SCXK鲁20130001),分笼饲养于山东中医药大学第一附属医院动物实验中心。

1.1.2试剂胆固醇(安徽天启华工科技有限公司，批号：20130612)；胆酸钠(河北银峰食品科技有限公司，批号：201306167)；白砂糖(福临门白砂糖，青岛中粮航引食品有限公司)；猪油(山东中医药大学附属医院餐厅熬制，猪肉购自大润发超市)；丙硫氧嘧啶片(50 mg，苏州东瑞制药有限公司，批号：130511001)；维生素D3注射液(1 mL：30万单位，上海通用药业股份有限公司，批号：121121)；豆油[金龙鱼大豆油，嘉里粮油(青岛)有限公司]；基础饲料(山东鲁抗医药股份有限公司)；0.9%氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司，批号：013042602)；戊巴比妥钠(山东中医药大学附属医院中心实验室提供，批号：090205)；葡萄糖测定试剂盒(己糖激酶法，贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号：AUZ1139)；总胆固醇测定试剂盒(酶法，贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号：AUZ0774)；甘油三酯测定试剂盒(GPO-POD法，贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号：AUZ0959)；高密度脂蛋白测定试剂盒(直接法，日本积水医疗株式会社，批号：808RHK)；低密度脂蛋白测定试剂盒(直接法，日本积水医疗株式会社，批号：806RFK)；MMP-9 (AB38898，ABCAM)；第二抗体试剂 SP-9001试剂盒(中杉金桥)；DAB显色试剂(中杉金桥)；PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1、pH 7.2～7.4，中杉金桥)。

1.2仪器白洋600A离心机；奥林巴斯AU2700全自动生化仪；德国莱卡RM2015石蜡切片机；德国Eppendorf-5430离心机；DSHZ-300型恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂)；DEIAS-2000丹吉尔医学图像分析系统(济南丹吉尔电子有限公司)；Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics 公司)。

2实验方法

2.1动物分组及饲养将64只大鼠分为基础饲料组和高脂饲料组，基础饲料组12只，高脂饲料组52只。基础饲料组给予基础饲料喂养8周，高脂饲料组给予高脂饲料(按照7%猪油、5%胆固醇、3%白砂糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、84.3%基础饲料的比例配置)喂养8周，同时于首次喂养的第3、5、7天按照700 000 U·kg-1的剂量给予维生素D3注射液[3]，灌胃3 d。

2.2生化指标检测大鼠喂养8周后，基础饲料组、高脂饲料组各取大鼠2只，只供水12 h，称重记录，用2%戊巴比妥钠按0.2 mL·(100 g)-1体重腹腔注射、麻醉，下腔静脉取血，摇匀，对称放入离心机，3 200 rpm，离心5 min，取上层血清，放入奥林巴斯AU2700全自动生化检测仪检测。

2.3组织病理切片、颈动脉MMP-9表达检测将已取血大鼠仰卧位固定，剥离大鼠颈部肌肉，分离颈动脉及伴行的迷走神经，剪取颈动脉放入盛有0.9%氯化钠注射液的培养皿中反复冲洗，直至血管冲洗干净。将摘取的一条颈动脉置于10%中性甲醛溶液中固定，酒精梯度脱水，浸腊包埋，二甲苯透明，常规切片，HE染色，用光学显微镜观察，取图；另一条颈动脉做免疫组织化学分析，400×显微照相。

3实验结果

大鼠下腔静脉血做生化指标检测，结果见表1。从表1中发现高脂饲料组大鼠血糖水平高于基础饲料组，这与高糖高脂饮食有关，血液中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平高脂饲料组大鼠明显高于基础饲料组。

表1　喂养10周后大鼠各项生化指标

大鼠颈动脉做病理切片见图1。图1A基础饲料组动脉内膜平滑无损伤，细胞排列整齐，厚薄均匀，偶见脂肪组织，出现少量空泡；图1B高脂饲料组大鼠动脉血管增生明显，细胞排列紊乱，脂质成分增多，淡蓝色区域较大，钙盐沉积较多，出现明显的灶化斑块，并且弹力纤维遭到破坏而变薄，灶化严重部分内膜断裂。

A

B 图1　大鼠颈动脉病理切片 A.基础饲料组；B.高脂饲料组

采用免疫组化技术对大鼠颈动脉MMP-9表达进行检测(见图2)，图中棕色区域为大鼠颈动脉MMP-9表达区域。从图2可以发现高脂饲料组大鼠颈动脉中MMP-9表达明显增多，基础饲料组大鼠颈动脉血管内膜平整，细胞排列整齐，偶见脂肪组织，存在少量空泡；高脂饲料组大鼠颈动脉血管内膜粗糙，细胞排列紧密、紊乱，有大量空泡。

通过两组大鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指标对比，以及大鼠颈动脉血管病理切片、免疫组化检测，发现与基础饲料组相比，高脂饲料组大鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平明显增高，颈动脉病理切片血管内膜粗糙，细胞排列紊乱，硬化斑块明显，免疫组化法检测MMP-9表达明显增多，成功建立大鼠动脉粥样硬化模型。

4讨论

动脉粥样硬化过程中伴随着脂质浸润、钙质沉着、炎症反应等，建立大鼠动脉粥样硬化模型，首先应该提供大量脂质，高比例的猪油、胆固醇提供了脂质来源；胆酸钠可以提高胆固醇的吸收量，有利于快速形成高脂血症[4]；大鼠无胆囊，单纯高脂饲料易使血清胆固醇升高，采用丙硫氧嘧啶可以抑制甲状腺功能[5]，降低了胆固醇的氧化和分解，从而升高胆固醇含量；灌胃给予维生素D3，可以促进血管钙化，同时造成内膜损伤，进一步促进粥样硬化的发生、发展。

C

D 图2　大鼠颈动脉MMP-9表达 C.基础饲料组；D.高脂饲料组

血液中的血脂主要指甘油三酯和胆固醇，两者有一项升高或都升高，则可定义为高脂血症。经过一段时间喂养后，高脂饲料组大鼠甘油三酯、总胆固醇含量升高，出现高脂血症。低密度脂蛋白可以与胆固醇结合而成低密度脂蛋白胆固醇，它是导致动脉硬化的重要因素，高脂饲料组大鼠血液中低密度脂蛋白含量明显增高说明其出现动脉粥样硬化的可能性提高。高密度脂蛋白和胆固醇结合形成高密度脂蛋白胆固醇，它可以将胆固醇从组织转移到肝脏中去，具有防治动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化的病理特点是动脉内膜细胞外基质(ECM)成分沉积，内膜增厚及中膜平滑肌细胞迁移增生、增厚[6]。血管重构包括细胞成分及细胞外基质的重构[7]，病变动脉通过内层细胞、ECM和脂质积聚导致结构改变时粥样硬化发生发

展[8]。而基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是体内降解细胞外基质的主要蛋白酶，它与细胞外基质的降解、重塑，以及平滑肌细胞的迁移、增殖有关。血管细胞外基质的合成与降解是维持血管结构完整性的重要机制[6]。颈动脉血管中MMP-9表达增多，细胞外基质以降解为主，有利于平滑肌细胞的迁移、增殖，形成新的内膜[9]，易于导致动脉粥样硬化的发生。

综上所述，大鼠经高脂饲料喂养一段时间后，甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白等生化指标升高，颈动脉中MMP-9表达增多，都提示大鼠动脉粥样硬化模型建立成功。

参考文献：

[1]殷亚昕，刘润梅，翟红霞，等.不同饲料联合维生素D3建立大鼠动脉粥样硬化模型的比较[J].中国康复理论与实践,2010,16(12):1134-1136.

[2]宋磊,钱之玉,陈真,等.动脉粥样硬化与炎症的关系及相关药物治疗[J].药学进展,2013,37(2):49-55.

[3]赵娟,李湘军,孙波,等.维生素D3联合高脂饲料建立大鼠动脉粥样硬化模型[J].实用医学杂志,2009,25(21):3569-3571.

[4]傅剑云,夏勇,孟佳,等.多因素致大鼠实验性动脉粥样硬化模型建立[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2487-2489.

[5]吴楠,陈平圣,李静,等.丙基硫氧嘧啶不同摄入方式对大鼠动脉粥样硬化形成的影响[J].现代医学,2011,39(2):142-146.

[6]于滢，杨向红.基质金属蛋白酶与动脉粥样硬化及斑块破裂的关系[J].中国动脉硬化杂志，2003,11(6):592-595.

[7]王献民，周同甫，刘斌，等.卡托普利及氯沙坦干预大鼠肺动脉高压与MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的关系[J].四川大学学报(医学版)，2009，40(2):255-259.

[8]鲁立,江渝.基质金属蛋白酶-9与动脉粥样硬化[J].生命的化学,2007,27(1):75-77.

[9]葛夕洪，杨晶，徐锐，等.MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管成形术后再狭窄中的表达及其意义的实验研究[J].中国介入影响与治疗学,2008,5(3):165-169.