塞来昔布对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

塞来昔布对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

石国一，秦占川,刘玉玲,王敏

(赞皇县医院,河北赞皇 051230)

摘要：目的探讨塞来昔布对结肠癌细胞HT-29增殖、凋亡的影响及机制。方法取对数生长期结肠癌细胞株HT-29，分别加入终浓度为10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞来昔布进行干预，MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡；Western blotting、RT-PCR法检测Cox-2表达。结果塞来昔布干预后HT-29细胞生长受到明显抑制，且呈时间、剂量依赖性(P均<0.05)。塞来昔布作用24 h后，HT-29细胞G0/G1期比例明显升高，S期细胞比例降低(P均<0.05)；塞来昔布处理后细胞凋亡率明显升高(P均<0.05)；细胞Cox-2蛋白及mRNA表达均明显降低(P均<0.05)。结论 塞来昔布可体外抑制结肠癌细胞株增殖并诱导凋亡，其机制可能与抑制Cox-2蛋白表达有关。

关键词：结肠癌；塞来昔布；HT-29细胞；细胞凋亡；Cox-2蛋白

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.013

中图分类号：R735.35文献标志码：A

收稿日期：(2015-06-10)

目前认为，结肠癌发生可能与慢性炎症刺激有关[1]，非甾体类抗炎药(NAIDs)可降低结肠癌发病风险[2]。Cox是NAIDs的主要作用靶点，包括Cox-1和Cox-2两种亚型。Cox-2可催化花生四烯酸转化为多种前列腺素产物，在炎症过程中发挥重要作用。研究[3]表明，结肠癌中可见到Cox-2过表达。塞来昔布是一种选择性Cox-2抑制剂，对包括结肠癌在内的多种肿瘤具有抑制作用，并可增强化疗药物效果[4]，但具体作用机制尚待进一步研究。2014年5月，我们探讨了塞来昔布对结肠癌细胞株HT-29细胞周期、细胞凋亡的影响及机制。

1材料与方法

1.1材料结肠癌HT-29细胞株购自上海细胞库；塞来昔布购自南京德宝生化器材有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司； AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自杭州联科生物公司；小鼠抗人Cox-2单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2细胞培养、分组及干预大肠癌细胞株HT-29采用10%胎牛血清的McCoy′s 5A培养液培养。选择对数生长期细胞，调整为单细胞悬液，接种于96孔板。10、20、40、80、160、320 μmol/L塞来昔布处理组分别加入终浓度为10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞来昔布，溶剂对照组给予DMSO。

1.3细胞生长存活率测算细胞培养24、48 h后，采用MTT法检测细胞增殖情况。根据公式计算细胞生长存活率：细胞生长存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4细胞周期及凋亡情况检测收集细胞，将细胞浓度调整为1×106/L。取0.5 mL细胞悬液，加入2 mL 75%冰乙醇，固定后检测细胞周期。同时取0.5 mL细胞悬液，离心弃上清,加入0.5 mL Binding Buffer重悬细胞，按说明书操作检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.5HT-29细胞Cox-2蛋白检测采用Western blotting法。收集细胞，PBS洗涤后加入适量RIPA细胞裂解液，置冰上孵育1 h，4 ℃、12 000 r/min离心30 min。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白。每一处理组取等量蛋白，95 ℃变性5 min后冷却上样。变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，封闭。加入1∶500稀释的小鼠抗人Cox-2单克隆抗体，4 ℃过夜。用1×TBS-T洗膜3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的1∶5 000浓度的二抗，反应1.5 h，洗膜后ECL发光法显色。

1.6HT-29细胞Cox-2 mRNA检测采用RT-PCR法。通过TRIzol一步法(Gibco公司)提取细胞总RNA。按反转录试剂盒(Promega公司)说明书操作合成cDNA。PCR反应体系：GoTaq Green Master 12.5 μL，上下游引物1 μL，2 μL反转录产物，加水至终体积25 μL。至PCR扩增仪上，95 ℃变性5 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环后72 ℃延伸10 min。Cox-2引物上游5′-CAGAGTTG-GAAGCACTCTATGG-3′；下游5′-GGACAGCCCTTCA-CGTTATT-3′。PCR产物置于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外分析仪观察并照相，凝胶分析软件分析各条带平均灰度值。

2结果

2.1塞来昔布对HT-29细胞生长的影响在20～320 μmol/L浓度范围内，塞来昔布对HT-29细胞的生长抑制呈浓度及时间依赖性(P均<0.05)。10 μmol/L浓度塞来昔布对细胞存活无明显影响(P>0.05)。10、20、40、80、160、320 μmol/L的塞来昔布作用24、48 h后细胞生长存活率见表1。

表1　 塞来昔布作用24、48 h后HT-29细胞

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.2塞来昔布对HT-29细胞周期分布的影响与对照组相比，塞来昔布处理细胞24 h后， 20、40、80 μmol/L基来昔布处理组G0/G1期细胞百分比明显升高(P均<0.05)。20、40、80 μmol/L塞来昔布处理组S期细胞比例较对照组明显减低(P均<0.05)，见表2。

表2　塞来昔布处理后HT-29细胞周期分布比例

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.3塞来昔布对HT-29细胞凋亡的影响20、40和80 μmol/L塞来昔布处理24 h后，HT-29细胞凋亡率分别为(9.56±0.71)%、(13.36±1.55)%和(17.45±2.21)%，对照组为(6.60±0.58)%，与对照组比较，P均<0.05。

2.4塞来昔布对Cox-2蛋白及mRNA表达的影响40 μmol/L塞来昔布处理组与对照组Cox-2蛋白表达量分别为0.196±0.035、0.542±0.047，Cox-2 mRNA表达量分别为0.413±0.051、0.926±0.063，两组Cox-2蛋白及mRNA表达比较，P<0.05。

3 讨论

结肠癌是我国较常见的胃肠道恶性肿瘤，近年来发病率呈上升趋势。许多患者确诊时已达晚期，不但丧失了手术机会，而且对放化疗敏感性下降，5年生存率不到20%[5]。因此，寻找新的治疗手段或药物十分必要。NSAIDs具有降低结肠癌发病率的作用，对结肠癌的治疗有重要意义。传统NSAIDs同时影响Cox-1与Cox-2表达，可造成包括胃肠道出血等在内的严重不良反应，临床应用受到限制。塞来昔布是选择性Cox-2抑制剂，可抑制多种肿瘤细胞增殖[6]，并增强放化疗对肿瘤的杀伤作用[7]。与传统NSAIDs相比，具有较好的耐受性[8]，因此具有较好的临床应用前景。本研究发现，塞来昔布在体外可抑制结肠癌细胞HT-29增殖，提示其具有一定的抗肿瘤作用。

为了进一步观察塞来昔布对HT-29细胞的抑制作用，我们通过流式细胞术检测HT-29细胞周期及凋亡情况。结果显示，塞来昔布作用后，G0/G1期细胞比例增加，而S期细胞比例降低，提示HT-29细胞发生了细胞周期G0/G1期阻滞。与对照组相比，塞来昔布处理组细胞凋亡率明显增高。提示塞来昔布可以通过诱导细胞周期阻滞、促进凋亡而发挥抑制HT-29细胞增殖的作用。这一过程可能涉及多个信号途径，如NF-κB型号通路[9]、p53[10]等。

Cox-2对肿瘤细胞的作用机制是目前研究热点。Cox-2是一种诱导表达型酶，生理状态下无表达或低水平表达，但在细胞因子、生长因子、致癌剂及某些癌基因产物的刺激下，其表达可明显增加[11]，促进花生四烯酸转化为多种前列腺素产物，在炎症及肿瘤的发生中起到重要作用。前列腺素E2(PGE2)是一种重要的Cox-2催化产物，与肿瘤血管新生及肿瘤细胞侵袭、转移、逃避免疫监视等密切相关[12]。研究发现，Cox-2抑制剂可下调肿瘤细胞中PGE2水平，并抑制细胞增殖。选择性Cox-2抑制剂如Celecoxib与其他药物具有协同作用，可通过下调mTOR信号途径活性抑制肿瘤细胞增殖[13]。本研究采用RT-PCR法检测发现，HT-29细胞中存在Cox-2表达。塞来昔布作用后，HT-29细胞中的Cox-2蛋白表达明显下降，提示塞来昔布可能通过下调细胞内Cox-2表达水平抑制其催化产物如PGE2的生成，以及影响其他信号通路活性，从而抑制结肠癌肿瘤细胞增殖。

综上所述，塞来昔布在体外可抑制结肠癌细胞增殖，诱导发生细胞周期阻滞及凋亡，其机制可能与抑制细胞中Cox-2蛋白表达有关。

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