甘草次酸衍生物TY501抗肺纤维化作用及机制研究

耿艳艳，于　冰，周植星，胡倩倩，徐为人，汤立达

(1.天津医科大学基础医学院, 天津　300070； 2.天津药物研究院，天津市新药设计与发现重点实验室，天津　300193)

甘草次酸衍生物TY501抗肺纤维化作用及机制研究

耿艳艳1,2，于冰2，周植星2，胡倩倩1,2，徐为人2，汤立达2

(1.天津医科大学基础医学院, 天津300070； 2.天津药物研究院，天津市新药设计与发现重点实验室，天津300193)

中国图书分类号：R-332；R284.1；R322.35；R563.130.22

摘要：目的探索甘草次酸衍生物TY501对博莱霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型大鼠的抗肺纤维化作用及初步机制。 方法将40只大鼠随机分成5组：假手术组、模型组、吡非尼酮组、TY501高剂量组和低剂量组。经气道给予BLM制备大鼠肺纤维化模型，每天灌胃给予受试药。实验结束后，测定肺系数、氧分压(PaO2)，测定BALF中ALB、ALP、LDH以及肺组织中GSH、HYP含量，测定血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(COL4)含量。结果① 肺纤维化早期肺泡炎阶段相关指标：各治疗组与模型组相比，肺系数显著下降(P<0.05)、PaO2明显升高(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组大鼠BALF中ALP、ALB以及LDH呈下降趋势(P<0.05)；模型组肺组织匀浆中GSH含量反馈性增高，与假手术组相比存在明显差异(P<0.05)，各治疗组较模型组含量降低(P<0.05)；(2)肺纤维化晚期肺间质纤维化阶段：大鼠肺组织HYP、血清PCⅢ(TGF-β通路指标)、血清COL4(MMPs通路指标)含量，各治疗组较模型组呈下降趋势，差异有显著性(P<0.05)。 结论TY501对肺纤维化治疗存在价值，能够减轻BLM诱导的肺纤维化程度。TY501可能通过阻断TGF-β的作用、抑制MMPs等多途径抑制肺纤维化的发生，减轻肺纤维化症状。

关键词：甘草次酸衍生物；TY501；特发性肺纤维化；博来霉素；转化生长因子-β；基质金属蛋白酶

2011年，特发性肺纤维化(IPF)循证医学指南中，将IPF定义为:一种病因不明的慢性纤维化性间质性肺炎，组织学和(或)胸部高分辨CT特征性表现为普通性间质性肺炎(UIP)的疾病[1]。目前最常用复制肺纤维化动物模型方法是气管内注入博莱霉素(bleomycin，BLM)，且这一动物模型被认为是最近似于 IPF 病理改变的模型[2]。甘草次酸及其衍生物具有广泛的药理作用，如抗炎、抗病毒、抑菌、保肝、解毒、抗肾损伤、抗肿瘤、免疫调节以及祛痰、抗氧化等等。但是，临床上应用该药常伴有假醛固酮增多症，表现为患者长期用药后出现水肿、湿疹、低血钾和钠潴留等不良反应。本课题组对甘草次酸母核进行改造，以脱氧甘草次酸为母体，在11位引入取代基异恶唑甲酰胺的取代基团，合成甘草次酸衍生物-TY501(Fig 1)，并申请专利[3]。前期研究[4-5]表明，TY501抗炎、镇痛、抗肝损伤、抗肾损伤、抗胃溃疡等方面具有良好的效果，且长期给药毒性低，具有很好的成药性。本实验就 TY501对抗肺纤维化作用机制进行初步探索，希望为临床治疗肺纤维化提供新的药物。

1材料

1.1实验动物SPF级♂ SD大鼠40只，体质量(204±19) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。

Fig 1Structure of TY501

1.2主要药品及试剂博莱霉素(15 mg一瓶，日本化药株式会社)；TY501(白色粉末，含量为97.8%，批号20100512，由天津药物研究院创新中心提供，实验前用5 g·L-1CMC-Na配制成适当浓度)；羧甲基纤维素钠800-1200(CMC-Na，化学纯，批号F20081015，国药集团化学试剂有限公司)；吡非尼酮(pirfenidone，PFD，淡黄色白色粉末，5 g一瓶)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；白蛋白(ALB)试剂盒、微量还原型谷胱甘肽测试盒、羟脯氨酸测试盒(南京建成生物工程研究所)；Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(COL4)ELISA试剂盒(Cloud-Clone公司)。

1.3主要仪器Sartorius BS124S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；HS3120 超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)；LDS-2A 型台式低速离心机(北京医用离心机厂制造)；TGL-16B 型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)SELECTAA-2 型自动生化分析仪(荷兰威图公司)；酶标仪(SUNRISE)；i-STAT300型血气分析仪(美国雅培公司)。

2方法

2.1动物分组及模型建立将40只 SD 大鼠随机分成 5 组。假手术组、模型组、吡非尼酮(50 mg·kg-1)组、TY501高剂量组(60 mg·kg-1)、TY501低剂量(30 mg·kg-1)组各8只。大鼠腹腔注射水合氯醛(360 mg·kg-1)麻醉，仰卧固定，经口行气管插管，并经插管缓慢注入0.2~0.3 mL BLM，剂量为5 mg·kg-1，然后迅速直立并旋转动物，使药液在肺内均匀分布；假手术组操作同上，气管内注入生理盐水0.3 mL。术后d 2开始给药，每天1次，连续给予21 d，假手术组及模型组给予5 g·L-1CMC-Na。

2.2指标测定

2.2.1肺系数测定末次给药后，腹腔注射水合氯醛(360 mg·kg-1)麻醉，分离肺脏，称取肺湿重(mg)，测量胫骨长度(mm)，计算肺脏/胫骨比值。

2.2.2血气分析末次给药后，经腹主动脉取血1 ml，进行血气分析，测定氧分压(PaO2)。

2.2.3BALF中ALB、ALP、LDH含量测定分离肺脏后，以37℃无菌生理盐水对肺脏行灌洗(5 mL×2)。收集肺泡灌洗液(BALF)，记录回收量，1 200 r·min-1离心10 min，分装后-80℃冻存。按照试剂盒方法测定BALF中ALB、ALP、LDH含量。

2.2.4肺组织匀浆谷胱甘肽(GSH)含量测定称取100 mg肺组织，加入1 mL NS进行肺组织匀浆，将匀浆液2 000 r·min-1离心10 min，取上清按照试剂盒方法检测GSH含量。

2.2.5肺组织羟脯氨酸(HYP)含量测定采用Jamall法[6]，称取100 mg肺组织(湿重)，测定HYP含量。

2.2.6血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(COL4)含量测定经腹主动脉取血2 mL，离心，取血清，采用ELISA法测定血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(COL4)含量，严格按说明书操作步骤进行操作。通过酶标仪比色，得出吸光度A值。由标准曲线计算出样品中胶原含量。

3结果

3.1肺系数及动脉血气分析指标氧分压变化d 21时，模型组肺系数明显高于假手术组(P<0.05)，氧分压则降低(P<0.05)；吡非尼酮组、TY501高、低剂量组肺系数相比模型组均呈下降趋势(P<0.05)，氧分压则升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 2。

3.2BALF中ALB、ALP、LDH含量变化d 21时，模型组较假手术组呈升高趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组与模型组比较，BALF中ALB、ALP、LDH含量下降趋势明显(P<0.05)，见Fig 3。

3.3肺组织匀浆中GSH含量变化d 21时，模型组GSH含量较假手术组升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组与模型组比较，GSH含量下降趋势明显(P<0.05)。见Fig 4。

#P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group, same as below

Fig 3　Changes of ALB(A),ALP(B),LDH(C)in BALF

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel

Fig 4Changes of GSH in lung tissue homogenate of

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel

3.4大鼠肺组织中HYP以及血清PC-Ⅲ、COL4含量变化d 21时，模型组肺组织HYP含量明显高于假手术组(P<0.01)，治疗组HYP含量均较模型组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组血清PC-Ⅲ、COL4含量明显高于假手术组(P<0.01)。TY501高、低剂量组血清PC-Ⅲ含量低于模型组(P<0.05)，而吡非尼酮组与模型组相比无明显差异(P>0.05)。治疗组血清COL4含量与模型组相比呈下降趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中TY501高剂量组较模型组差异有显著性(P<0.01)。见Tab 1。

Tab 1Contents of HYP,PC-Ⅲ,COL4

GroupDose/mg·kg-1HYPcontent/μg·g-1PC-Ⅲcontent/μg·g-1COL4content/μg·g-1Sham-67.9±20.49.3±2.6263.2±70.3Model-120.8±27.8#16.4±4.2#496.3±111.1#PFD5067±24.1*10.7±3.1353±76.1*TY501-H6075.8±26.4*10.4±1*292.2±68.5**TY501-L3087.7±18.7*11.1±2.1*329.5±132.8*

#P<0.05vssham;*P<0.05;**P<0.01vsmodel

4讨论

4.1IPF发生机制及主要测定指标IPF主要表现为弥漫性肺间质纤维化，伴随轻度炎症、成纤维细胞灶与正常肺组织并存、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量增生和沉积、蜂窝组织的形成。肺间质纤维化早期以肺泡炎为主，后期成纤维细胞大量增生、胶原沉积，逐渐发展为不可逆的肺间质纤维化[7-8]。

肺泡炎阶段常见指标包括BALF中ALB、ALP、LDH、肺组织GSH等。组织学研究[9]表明，IPF患者Ⅱ型上皮细胞ALP明显增多，它参与组织损伤和修复，参与局部免疫和防御反应；由气道上皮细胞产生的LDH在肺泡炎症性损伤后可明显增高，用以反映炎症损伤严重程度。IPF肺泡炎阶段，致病因子导致肺泡上皮细胞受损，肺部ROS病理性增多，ROS可通过脂质过氧化损伤、蛋白质损伤、DNA损伤、细胞因子网络失衡等途径导致肺间质纤维化。谷胱甘肽(GSH)是一种重要的抗氧化剂，已发现主要存在于肺泡上皮衬液(ELF)中，肺内局部GSH缺乏加重由氧自由基释放量增加造成的肺泡上皮细胞损伤。

肺间质纤维化过程包括大量的成纤维细胞聚集、ECM沉积、胶原形成并伴有炎症和损伤所致的组织结构破坏为特征。转化生长因子β(TGF-β)被认为是纤维化形成与发展的启动枢纽，能促进多种ECM成分(如COL1、COL3)的合成、成纤维细胞增殖和生长以及阻止ECM降解，在器官纤维化过程中存在不同程度的表达。HYP是胶原纤维中特有的一类氨基酸，其他组织几乎不含有HYP；PCⅢ是COL3的前身，它由产生胶原的细胞合成后被分泌到细胞外，在内切酶作用下，前胶原释放羧基和氨基末端多肽(即PⅢP)后转化为原胶原分子，然后原胶原分子交联成胶原纤维，二者可作为TGF-β的下游指标或肺纤维化程度指标。此外，IPF两个阶段均有ECM代谢失衡的变化[10]，肺组织ECM的处于增生与降解的动态平衡，增生主要由肺成纤维细胞与Ⅱ型上皮细胞增殖活化引起，降解则由基质金属蛋白酶(MMPs)与丝氨酸蛋白酶等蛋白酶所调节。MMPs根据降解的底物不同可分为3类(Tab 2)[11]。当肺组织中MMPs表达及活性增高时， 肺组织中正常胶原蛋白被纤维性间质取代，最终导致肺纤维化的形成。MMP-2、MMP-9的作用底物主要是ECM成分中Ⅳ型胶原(COL4)。纤维化过程中，COL4等ECM成分在增生同时又有降解，组织结构的反复破坏与重构，最终导致肺纤维化。综上，COL4的测定对MMPs通路具有重要意义。

Tab 2　Types of MMPs (according to substrate species)

4.2吡非尼酮抗IPF主要机制2011年IPF循证医学指南[1]指出，基于发表的循证医学的资料结果显示，至今尚无证实有特效治疗IPF的药物。目前唯一被部分国家批准用于IPF治疗的药物就是吡非尼酮，该药于2011年9月获得我国SFDA的新药证书，2014年7月FDA宣布认定吡非尼酮为IPF突破性治疗药物，这意味着FDA会推进该药的研发并加快复审[12]。故本实验中采用吡非尼酮为阳性对照药物，实验结果更有价值。

吡非尼酮是口服的吡啶类药物，能调节许多细胞因子，包括TGF-β、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α，改变胶原表达合成和累积，抑制细胞外基质增殖和表达[13]，具有抗炎、抗氧化及抗纤维化的作用。PFD 能够减少MMPs的表达，调节平滑肌细胞增殖和迁移[14]，抑制 NAPDH 相关的脂质过氧化反应。Iyer等[15]证实吡非尼酮可以抑制纤维化肺组织的脯氨酸羟化酶的活性，减少HYP的生成，抑制Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因的转录，减少肺胶原的含量。本实验吡非尼酮组炎性指标与模型组相比较，均明显降低；HYP、PCⅢ、COL4晚期肺间质纤维化指标较模型组呈下降趋势，与Iyer实验结果一致，表明本实验可靠性。

我们采用BLM诱导大鼠肺纤维化模型，从实验结果分析可知：各指标组内差异小，结果稳定；与假手术组相比较，肺泡炎性指标均升高，即BLM已经导致大鼠肺组织炎性损伤；HYP、PCⅢ、COL4含量较假手术组升高，与金晓光等[7]实验结果一致，表明本次实验建模成功，所测指标可信度高。

4.3TY501作用机制

4.3.1IPF肺泡炎阶段实验d 21时，TY501高、低剂量组BALF中ALP、ALB、LPH含量较模型组呈下降趋势，与阳性对照药物吡非尼酮组趋势一致，同时与郑锐等[16]的研究结果一致。提示TY501可缓解肺纤维化大鼠肺泡炎症，降低炎症损伤程度，减轻大鼠肺纤维化症状。

刘瑞等[17]研究显示，模型组大鼠IPF初期肺泡炎明显，实验d 3、d 7时，作为细胞内最丰富的抗氧化剂，GSH在细胞清除ROS过程中发挥关键作用，尤其在肺纤维化早期炎症阶段大量耗竭，14、28 d时，GSH反馈性增高，提高肺脏抗氧化能力以对抗氧自由基，保护肺组织免受氧化损伤。本实验中，模型组大鼠GSH含量高于假手术组(P<0.05)，治疗组大鼠GSH含量低于模型组(P<0.05)；这表明TY501对肺组织损伤具有保护作用，而TY501能否在肺炎初期促进GSH合成，有待进一步研究。

4.3.2IPF肺间质纤维化阶段本实验结果表明，两个剂量TY501组、吡非尼酮组肺纤维化大鼠肺组织HYP含量均低于模型组，差异有显著性；ELISA法所检测的Ⅲ型前胶原(PCⅢ)含量治疗组较模型组明显降低。由此可得出：TY501与吡非尼酮作用效果一致，能够降低IPF大鼠肺组织中HYP含量、胶原含量、ECM沉积，提示TY501可通过影响ECM的合成而发挥抗肺纤维化。由前文叙述可知，HYP、PCⅢ的降低与TGF-β有关，吡非尼酮主要机制即抑制TGF-β作用，故推测TY501与吡非尼酮相似，其抗肺纤维化作用与对TGF-β具有抑制作用有关。

肺纤维化大鼠肺组织中MMPs蛋白呈高表达，其中MMP-2可通过降解破坏正常肺组织的Ⅳ型胶原，而促进肺成纤维细胞等活化与肺纤维化，研究证明[14]吡非尼酮抗肺纤维化与此有关。本实验结果显示d 21，高、低剂量TY501、吡非尼酮明显降低IPF大鼠异常升高的肺组织Ⅳ型胶原，提示TY501可通过抑制胶原蛋白病理增生而发挥抗肺纤维化作用。推测TY501的作用机制与吡非尼酮一致，能够抑制MMPs表达以及活性，以减轻纤维化肺组织炎症、组织破坏与ECM生成细胞活化。MMP-2在此过程中含量以及表达情况还有待进一步的深入研究。

4.4小结本次实验采用经气道给予BLM制备大鼠特发性肺纤维化模型，与假手术组相比，肺纤维化大鼠各个炎性指标均呈升高趋势，均能发生肺部炎症、ECM沉积、胶原生成等。阳性对照药吡非尼酮抗肺纤维化机制较明确，本实验中吡非尼酮组与模型组相比所得结果与文献报道一致，结果可靠。TY501高剂量组(60 mg·kg-1)、低剂量组(30 mg·kg-1)对IPF大鼠模型均表现出治疗作用，与吡非尼酮一致，即TY501能够减轻肺大鼠肺纤维化程度，对肺纤维化治疗具有重要价值。

TY501能够减轻肺部炎症损伤，HYP、PCⅢ含量较模型组减少，我们推测TY501与吡非尼酮类似，能够抑制TGF-β作用，阻断与其相关的通路如TGF-β/Smads信号传导通路，抑制成纤维细胞激活、胶原产生，在肺纤维化的形成过程中发挥重要作用。MMPs对肺纤维化中肺组织ECM的降解具有关键作用，IPF大鼠给予TY501后，COL4(MMPs下游指标)含量较模型组降低，我们推测TY501对该通路也具有一定作用。

总而言之，TY501极有可能为多通路抗IPF药物，期待进一步研究所得到的结果，为改善IPF患者的生活质量和延长生命做出努力。

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网络出版时间：2015-1-9 13:37网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.013.html

Antifibrotic effect of TY501 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis

in rats and related mechanism

GENG Yan-yan1,2, YU Bing2, ZHOU Zhi-xing2, HU Qian-qian1,2, XU Wei-ren2, TANG Li-da2

(1.BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofMolecularDesignand

DrugDiscovery,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,China)

Abstract:AimTo investigate TY501′s role in bleomycin(BLM)-induced pulmonary fibrosis in rats．MethodsForty rats were randomly divided into 5 groups, including the sham operation, BLM, PFD, TY501(high and low dose) groups. After administration of BLM intratracheally, PFD and TY501 were given in each group daily, according to the dosage designed during 21 days．Lung coefficient, PaO2were tested before killing the rats. The contents of ALB, ALP, LDH, GSH, HYP were detected by regent kit respectively. PCⅢ and COL4 were determined by ELISA. Results(1)Some indicators of alveolitis in early stage of IPF: the contents of lung coefficient in three treatment groups were lower and PaO2was higher than those in BLM group (P<0.05); compared with BLM group, the contents of ALB, ALP, LDH in the treatment groups reduced on 21st day (P<0.05); the expression of GSH in BLM group was increased for feedback regulation and higher than the treatment groups and the sham operation group (P<0.05); (2) some indicators of pulmonary interstitial fibrosis in late stage of IPF:the expressions of HYP, PCⅢ and COL4 were reduced after the treatment. There were significant differences compared with BLM group (P<0.05). ConclusionsTY501 is valuable for the therapy of IPF, the same as the positive drug pirfenidone. TY501 attenuates BLM-induced pulmonary fibrosis,which may be related to the affection of TGF-β pathway and inhibition of MMPs.

Key words:glycyrrhetic acid derivatives; TY501; IPF; bleomycin;TGF-β; MMPs

通讯作者于冰(1973-)，男，副研究员，研究方向：新药研发，，Tel:022-23006815，E-mail:yub@tjipr.com; 徐为人(1965-)，男，博士，研究员，研究方向：药理与药物设计,,Tel:022-23006815，E-mail：xuwr@tjipr.com

作者简介：耿艳艳(1994-)，女，硕士生，研究方向：药理学，E-mail：13512202058@126.com;

基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划(No 13JCZDJC 28500)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(No 14JCQNJC13000)

收稿日期:2014-10-26,修回日期:2014-12-09

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2015)02-0210-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.013