持续静脉-静脉血液滤过治疗对早期严重脓毒症患者细胞免疫功能的影响

申庆民 李文雄 赵松 郑悦 辛欣 黄立锋

严重脓毒症(severe sepsis)是创伤、烧伤、休克和感染等危重患者的常见并发症之一,也是诱发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction, MODS)的重要原因,病死率高达30%以上[1]。研究显示,连续静脉-静脉血液滤过(continuous venous-venous hemofiltration, CVVH)能够降低严重脓毒症患者的血清细胞因子水平,因而有可能改善其临床状况[2],本研究拟在此基础上评价CVVH对早期严重脓毒症患者细胞免疫功能及临床评分的影响。

资料与方法

一、一般资料

纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)诊断为严重脓毒症≤48 h；脓毒症的诊断标准：患者存在明确感染或可疑感染,具有感染的全身性表现。严重脓毒症的诊断标准：罹患脓毒症并伴有脓毒症诱导的器官功能障碍或组织低灌注,包括乳酸酸中毒、少尿或急性意识状态改变等[3]。排除标准：(1)妊娠期妇女；(2)慢性终末期疾病；(3)预期在下一个48 h内死亡的临终状态患者；(4)放弃治疗者；(5)不同意签署知情同意书者。共纳入2013年1月至2016年1月,本院外科ICU(SICU)连续收治的78例早期严重脓毒症患者,其中男性41例,女性37例,年龄27～75岁,平均年龄为54.4±5.6岁。患者原发病包括：严重肺部感染25例,多发伤16例,腹部大手术后合并严重腹腔感染14例,急性重症胰腺炎12例,肝移植术后肝功能延迟恢复9例,产后羊水栓塞合并大出血2例。合并2个脏器功能障碍或衰竭33例,3个脏器功能障碍或衰竭31例,4个脏器功能障碍或衰竭9例,5个脏器功能障碍或衰竭5例。55例患者需用血管收缩药物维持血压。78例患者依据适应证、禁忌症及家属知情选择的不同,分为常规治疗组32例和CVVH组46例。两组患者在年龄、性别、病种及病情危重程度等方面比较无统计学差异(P> 0.05)。本研究经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会同意,并签署患者知情同意书后进行。

二、方法

1.一般治疗：两组患者均依据《拯救脓毒症运动(SSC)2012指南更新》[4]进行常规治疗,CVVH 组加用CVVH 治疗。

2.CVVH 治疗方案：所有患者均在诊断为严重脓毒症的48 h内接受 CVVH 治疗,经右侧颈内静脉或股静脉置管建立血管通路,使用BRAUN Diapact CRRT机,选用Frensius AV600S聚砜膜滤器,血流量200～250 mL/min,超滤率：35 mL·kg-1·h-1,均使用前稀释法输注置换液,每24小时更换滤器,CVVH 持续时间≥ 48 h。无明显出血倾向者采用普通肝素全身抗凝,滤器前部分活化凝血活酶时间(APTT)维持在70～100 s。有显著出血倾向者,CVVH 治疗过程中每小时采用100 mL 0.9%等渗盐水冲洗滤器。

3.标本采集：分别于开始CVVH治疗前(0 h)和治疗后24 h、48 h抽取患者外周静脉血10 mL。

4.T淋巴细胞亚群测定：在上述时间点留取静脉血100 μL,加入含有20 μL CD4、CD8荧光标记抗体(购自深圳晶美生物工程有限公司),混匀,避光室温孵育30 min。加入500 μL 红细胞裂解液,孵育15 min,0.9%等渗盐水洗涤1次。离心弃上清,加入500 μL 0.9%等渗盐水混匀,静置10～15 min。流式细胞术(FACS)测定CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比,并记录CD4+/CD8+比值。

5.血清细胞因子检测：在上述时间点留取静脉血5 mL,自然析出上清液(血清),收集标本置于-30℃冰箱保存,用于细胞因子TNF-α、IL-2和IL-4水平检测。

6.疾病严重程度评分：分别于上述时间点评价并记录患者的急性生理与慢性健康状况评分(APACHE Ⅱ)及序贯性脏器衰竭评价评分(SOFA评分)变化情况。

三、 统计学分析

结 果

一、两组患者治疗前后T淋巴细胞亚群比较

两组患者在治疗前CD4+、CD8+T淋巴细胞百分数和CD4+/CD8+比值比较差异无统计学意义(P> 0.05),治疗48 h后,CVVH组患者CD4+T淋巴细胞百分数和CD4+/CD8+比值显著升高,CD8+T淋巴细胞百分数显著降低,与同组患者治疗前及同期常规治疗组患者比较差异均有统计学意义(P<0.05),提示脓毒症患者的细胞免疫抑制状态得到改善。常规治疗组患者上述指标与CVVH组变化趋势相同,但治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

二、两组患者治疗前后血清细胞因子水平比较

两组患者治疗前TNF-α、IL-2和IL-6表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗48 h后,CVVH组患者TNF-α、IL-2和IL-6表达水平显著降低,与同组患者治疗前及同期常规治疗组患者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。常规治疗组患者上述指标与CVVH组变化趋势相同,但治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 常规治疗组和CVVH组治疗前后T淋巴细胞亚群比较

注：与CVVH组0 h比较:aP<0.05；与常规治疗组48 h比较:bP<0.05

表2 常规治疗组和CVVH组患者治疗前后血清细胞因子水平比较

注：与CVVH组0 h比较:aP<0.05；与常规治疗组48 h比较:bP<0.05

三、两组患者治疗前后临床评分比较

两组患者在治疗前APACHEⅡ评分及SOFA评分比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗48 h后,CVVH组患者APACHEⅡ评分及SOFA评分显著降低,与同组患者治疗前及同期常规治疗组患者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。常规治疗组患者上述指标与CVVH组变化趋势相同,但治疗前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

讨 论

严重脓毒症的高病死率与机体免疫细胞低反应状态相关,免疫功能紊乱可能影响疾病的发展和其他治疗的疗效,直接影响脓毒症患者的预后[5]。严重脓毒症患者单核细胞和淋巴细胞的数量因过度抑制而处于低限,表现为单核细胞呈递抗原功能减弱、抗原特异性T、B淋巴细胞凋亡的免疫麻痹状态[6]。T细胞表面的CD分子不仅是T细胞分化的产物,也是T细胞发挥生物学功能的分子基础,T淋巴细胞亚群的变化反映了人体细胞免疫机能的改变[7]。CD4+细胞代表辅助性T淋巴细胞(Th),CD8+细胞代表抑制性T淋巴细胞。正常情况下,CD4+细胞和CD8+细胞处于动态平衡及相互反馈调节状态,CD4+/CD8+比值可反映机体的免疫功能状态,CD4+/CD8+比值降低反映细胞免疫功能处于抑制状态[8-9]。本研究发现,早期严重脓毒症患者在CVVH治疗前其T淋巴细胞亚群分布处于抑制状态,经CVVH 治疗48 h后,其CD4+细胞百分数、CD4+/CD8+比值较治疗前和常规治疗组均有不同程度的升高,而CD8+细胞百分数有所下降。提示CVVH可能通过降低血清细胞因子水平,减少了细胞因子对淋巴单核细胞的再刺激,使炎症介质分泌减少,避免了炎症介质的级联效应,使处于抑制状态的单核细胞得以逐渐恢复,显著改善了单核细胞的分泌功能,调节其过度活跃或过度抑制状态,调节T淋巴细胞亚群,因而可明显改善严重脓毒症患者已下调的T淋巴细胞的数量和比例,进而改善其免疫抑制状态,重建患者机体免疫系统内稳态。

表3 常规治疗组和CVVH组患者治疗前后临床评分比较

注：与CVVH组0 h比较:aP<0.05；与常规治疗组48 h比较:bP<0.05

T淋巴细胞识别经由抗原提呈细胞提呈的抗原而活化,其中CD4细胞激活后分化成两种辅助T淋巴细胞亚群即Thl、Th2,释放的细胞因子发挥免疫功能。Thl、Th2型细胞因子具有对抗性,Thl释放TNF-α、IL-2、IFN-γ等促炎因子；Th2释放IL-4、IL-10等抗炎因子。CD4+T淋巴细胞分化的偏移是导致脓毒症发生后机体免疫状态从亢进到抑制转变的重要因素。探讨T淋巴细胞具有免疫功能的细胞因子的变化情况,可为恢复感染后抗炎/促炎的平衡提供新的调控手段。本研究结果显示,与治疗前及常规治疗组比较,CVVH治疗后48 h血清TNF-α、IL-2及IL-6等细胞因子显著下降。究其原因,CVVH滤器膜孔径可允许分子量为30 000～50 000道尔顿的溶质被滤出,多数中小分子物质包括各种活化的补体成分、趋化因子、小肽和血管源性物质,以及尿素氮、肌酐、胍类等可经CVVH滤过；滤器还可以吸附部分炎症介质和细胞因子[10]；CVVH可以非选择性地清除血清促炎与抗炎细胞因子,降低血清细胞因子“峰”浓度,非特异地下调全身炎性反应,低一级水平的促炎和抗炎介质又可为机体免疫自稳状态的恢复提供条件,因而有可能降低免疫紊乱对器官功能的损伤程度[11]。

本研究还发现,早期严重脓毒症患者经过CVVH治疗后,APACHE II评分和SOFA评分均较治疗前及常规治疗组显著降低,提示早期CVVH能够改善患者的器官功能和临床状况。这与其能够选择性地清除炎症介质、恢复免疫平衡、改善症状、稳定血流动力学、逆转器官的损伤紧密相关。由于本组样本例数尚少,存在一定的局限性,尚需进一步的大样本研究,从而为脓毒症的预防与治疗提供新思路。

1 黄立锋,姚咏明,董宁,等．血浆凝溶胶蛋白水平对严重烧伤脓毒症患者预后的意义[J] ．中华烧伤杂志,2016,32(2)：77-81.

2 Iwagami M,Yasunaga H,Noiri E,et al. Potential Survival Benefit of Polymyxin B Hemoperfusion in Septic Shock Patients on Continuous Renal Replacement Therapy: A Propensity-Matched Analysis[J]. Blood Purif,2016,42(1)：9-17.

3 Angus DC,van der Poll T. Severe sepsis and septic shock[J]. N Engl J Med,2013,369(9)：840-851.

4 黄顺伟,管向东．拯救脓毒症运动(SSC)2012 指南更新概要[M]．北京：人民卫生出版社,2013:79-88.

5 Huang LF,Yao YM, Sheng ZY. Novel insights for high mobility group box 1 protein-mediated cellular immune response in sepsis: A systemic review[J]. World J Emerg Med,2012,3(3)：165-171.

6 Shao R,Li CS,Fang Y,et al. Low B and T lymphocyte attenuator expression on CD4(+) T cells in the early stage of sepsis is associated with the severity and mortality of septic patients: a prospective cohort study[J]. Crit Care,2015,19：308.

7 Darcy CJ,Minigo G,Piera KA,et al. Neutrophils with myeloid derived suppressor function deplete arginine and constrain T cell function in septic shock patients[J]. Crit Care,2014,18(4)：163.

8 黄立锋,姚咏明,张立天,等．严重烧伤后调节性T细胞免疫活性变化及其与患者预后的关系[J]. 中华创伤杂志,2010,26(9)： 785-789.

9 Markwart R,Condotta SA,Requardt RP,et al. Immunosuppression after sepsis: systemic inflammation and sepsis induce a loss of na?ve T-cells but no enduring cell-autonomous defects in T-cell function[J]. PLoS One,2014,9(12)：e115094.

10 Dabrowski W,Kotlinska-Hasiec E,Schneditz D,et al. Continuous veno-venous hemofiltration to adjust fluid volume excess in septic shock patients reduces intra-abdominal pressure[J]. Clin Nephrol,2014,82(1)：41-50.

11 Dabrowski W,Kocki T,Pilat J,et al. Changes in plasma kynurenic acid concentration in septic shock patients undergoing continuous veno-venous haemofiltration[J]. Inflammation,2014,37(1)：223-234.