白虎汤对内毒素致热家兔的解热作用及其机制研究

白虎汤对内毒素致热家兔的解热作用及其机制研究

杨斌，徐向东*

(山东省中医院，济南 250011)

摘要：目的探讨白虎汤对内毒素发热家兔的解热作用及其机制。方法将32只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、白虎汤低、高剂量组(10,20 g/kg)，造模前，空白、模型2组分别灌胃等量生理盐水，白虎汤低、高剂量组分别灌胃不同剂量药物,1次/d，连续5 d。第6天，除正常组外，其余3组分别通过耳缘静脉注入大肠杆菌内毒素方法复制发热家兔模型，观察各组动物症状及体温变化；采用双抗体夹心ELISA法检测血清细胞因子IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α水平；采用流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平。结果与正常组相比,模型组家兔体温,TNF-α、IL-1β、IL-6、ET和CD8+水平显著上升(P<0.01),CD4+水平与CD4+/CD8+显著下降(P<0.01)；与模型组相比，白虎汤高、低剂量组家兔体温、TNF-α、IL-1β、IL-6、 ET、CD8+水平明显下降(P<0.05或P<0.01),CD4+水平与CD4+/CD8+显著上升(P<0.05或P<0.01)。白虎汤高、低剂量均对内毒素性发热家兔有显著的解热效应(P<0.05或P<0.01)，均可明显抑制发热家兔TNF-α、IL-1β、IL-6、ET、CD8+水平升高(P<0.05或P<0.01)，促进CD4+水平与CD4+/CD8+显著上升(P<0.05或P<0.01)。结论白虎汤对内毒素性发热家兔有解热的作用，机制可能是通过抑制发热家兔致热性细胞因子的释放，调节机体免疫功能而发挥其解热的作用。

关键词：内毒素；发热；白虎汤；家兔

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.023

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)05-0508-04

基金项目:山东省自然科学基金(Y2006C113)。

作者简介:杨斌(1971-)，男，主管药师，主要从事中药新药开发及中药炮制原理的研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-10-20)

*通信作者:徐向东，电话-13793188391，电子信箱-zhengsanxiasd@126.com

Antipyretic effect and mechanism of action of Baihu decoction for fever rabbits caused by endotoxin

YANG Bin,XU Xiangdong*

(Affiliated Hospital to Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Ji’nan 250011,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the antipyretic effect and mechanism of Baihu decoction for fever rabbits caused by endotoxin.MethodsThe 32 New Zealand rabbits were randomly divided into normal group,model group,Baihu decoction low-dose group,high-dose group (10,20 g/kg).Before modeling,blank group and model group,two groups were given amount of normal saline respectively,Baihu decoction low-dose group,high-dose group were given doses of drugs respectively,once a day,and lasted five days,The sixth day,except the normal group,the other 3 groups were injected through ear vein Escherichia Coli Endotoxin replication fever in rabbits model,to observe the change of symptoms and body temperature of each animal;Using double antibody sandwich EllSA method to test the levels of serum IL-1β,IL-6,tumor necrosis factor TNF-a.Using flow cytometry to test the levels of Tlymphocyte subsets and CD4+,CD8+.ResultsCompared with normal group,the model group significantly increased body temperature in rabbits,TNF-α,IL-1β,IL-6 and CD8+ levels(P<0.01),CD4+ level and CD4+/CD8+ decreased significantly(P<0.01);Compared with the model group,Baihu decoction high dose group significantly decreased in low dose group rabbits body temperature,TNF-α,IL-1β,IL-6 the level of CD8+(P<0.05,P<0.01),increased CD4+ levels and CD4+/CD8+ (P<0.05 or P<0.01).Baihu tang Low-dose group,high dose group both had antipyretic effect significantly for fever rabbits caused by endotoxin(P<0.05 or P<0.01),can inhibit the fever in rabbits TNF-α,IL-1β,IL-6,CD8+ levels (P<0.05 or P<0.01),promote the significant increase of the CD4+ level and CD4+/CD8+(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe Baihu decoction has antipyretic effect on rabbits with endotoxin fever,mechanism may be the inhibition on fever in rabbits induced heat release of cytokines,regulate immune function and its antipyretic role.

Keywords:endotoxin;fever;Baihu decoction;rabbit

白虎汤出自《伤寒论》，主治伤寒阳明热盛证，或温病气分热盛证，后世医家沿用不衰，现代临床更有广泛应用。尤其在急性传染性疾病和急性感染性疾病的治疗方面，有很好的疗效。对于温病高热症，包括肺炎高热，腮腺炎高热，肾盂肾炎高热，急性化脓性扁桃体炎高热，施以白虎汤加减治疗效果明显。本实验在成功复制发热家兔模型基础上，观察内毒素致热家兔模型的作用及机制。

1实验材料

1.1药物白虎汤药物组成:石膏一斤(50 g)碎，知母六两(18 g)，炙甘草二两(6 g)，粳米六合(9 g)。所有中药购自山东省中医院,并经本院国家中药三级实验室张学顺主任药师鉴定。中药制备方法：石膏先煎20 min，继之将知母、粳米、甘草放入药液中浸泡15 min，以武火煮沸后再以文火煎30 min，取药物滤液，减压浓缩至100%水煎液，4 ℃冰箱保存备用。所有药物的家兔用量按人和动物间等效剂量换算方法折算[1]，得出家兔的白虎汤等效剂量为5 g/kg。

1.2动物普通级新西兰白兔32只,雌雄各半，体质量1.5～2.5 kg，由山东省农业科学院动物实验室提供，许可证号:SCXK(鲁)20040013。

1.3试剂与仪器大肠杆菌内毒素(ET，Escherichia coli 0127∶B8)购于Sigma Aldrich公司；血清型0127∶B8，用前以生理盐水稀释成5 μg/mL的溶液。IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-αELISA试剂盒，异硫氰酸荧光素标记的鼠抗兔CD4和CD8单克隆抗体购于美国Sigma公司(进口分装)。标准温度计，上海医用仪表厂；微量移液器，德国艾本德(eppendorf)；DDL-5低温离心机，上海安亭科学仪器厂生产；MDF-D5410三洋低温冰箱,日本三洋公司生产；381MC型酶标仪，上海三科仪器有限公司;BECTON DICKINSON流式细胞仪。

2实验方法

2.1分组、造模与体温测定将32只家兔随机分为正常组、模型组、白虎汤高剂量组、白虎汤低剂量组，每组各8只。适应性喂养1 d。造模前24 h将动物置于家兔固定箱内，测温时将涂有石蜡油的体温计插入直肠内，待动物稳定后记录体温，每隔30 min测温1次，取3次的均值作为家兔基础体温。取平均数进行统计处理，条件齐同者纳入实验程序。第3天,白虎汤高剂量组、低剂量组(20，10 g/kg)分别以等效剂量4倍、2倍的药物灌胃1次，正常组、模型组灌喂等量生理盐水，连续5 d，第7晚喂饲后各组禁食禁水。第8天，除正常组外，其余各组动物皆按照文献[2]方法进行造模，每只动物由耳缘静脉注入大肠杆菌内毒素液200 μg/kg，正常组注入等量生理盐水。观察各组动物的耳、皮肤、结膜、舌、渴饮、摄食、神志及全身状态等的变化情况。监测各组动物分别于造模后5 h内体温,每0.5 h各测定肛温1次。体温测试采用ST-1型数字体温计(上海医用仪表厂)。观察3 h温差(ΔT3=体温上升的最高值一基础体温值)及5 h体温指数(TRI5=体温变化曲线下面积)。

2.2检测指标5 h后由耳缘静脉采血，取6 mL血，分别加入2只2% EDTA-Na2抗凝的试管中，取抗凝全血1 mL，加100 μL单抗，避光15 min，加入红细胞裂解液0.5 mL，室温放置10 min，以1 000 r/min离心10 min，取沉淀以PBS洗2遍，弃上清，加入10 mL PBS混匀后上机检测。一只试管颠倒摇匀后置于4 ℃、3 000 r/min的离心机中离心10 min,吸取上层血清，保存于-70 ℃冰箱中。血清中细胞因子(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平的检测均依照ELISA试剂盒操作说明进行。

3实验结果

3.1症状与体征模型组动物在造模后30 min～1 h开始发热，并出现耸毛、发抖、蜷缩；2 h后模型组体温明显上升，呼吸急促，部分家兔出现稀便；3 h体温达到最高点，大部分家兔出现呼吸困难，口唇紫绀，结膜充血，精神萎靡，瘫卧或抽搐惊跳，舌质紫暗或呈紫灰色，但结膜及皮下未见出血点及疲斑，耳缘注射处也未见出血。白虎汤低剂量组家兔上述表现不如模型组严重，仍可见呼吸急促，心跳加快，舌质偏红；白虎汤高剂量组家兔可见呼吸急促、精神差，但无心跳快、结膜充血及舌质偏红。正常组家兔均未见上述异常表现。提示白虎汤能改善实验动物的症状和体征。

3.2白虎汤对内毒素致热家兔体温的影响见表1。

组 别剂量/(g/kg)ΔT3/℃TRI5/cm2正常组 —0.26±0.02 8.27±3.40 模型组 —1.71±0.26## 53.26±17.33## 白虎汤低剂量组100.91±0.15##△28.07±4.54##△白虎汤高剂量组200.71±0.23#△△16.07±5.64#△△

注：与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01

3.3白虎汤对内毒素致热家兔IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响见表2。

表2　白虎汤对内毒素致热家兔IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响

注：与正常组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01

3.4白虎汤对内毒素致热家兔CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影响见表3。

表3　白虎汤对内毒素致热家兔CD4 +、CD8 +、CD4 +/CD8 +的影响

注:与正常组相比,##P<0.01;与模型组相比,△P<0.05,△△P<0.01

4讨论

温病的发生除有外邪——温热毒邪感染外，还取决于机体正气的强弱及外界环境因素的变化。造模时，首先要使模型具备温病气分证的基本病理特征。内毒素可以作用于许多动物建立模型，但家兔对内毒素极为敏感，而且家兔对内毒素的生物学反应与人类相似，因此笔者选择家兔作为实验动物，攻毒材料笔者选用大肠杆菌内毒素。据研究表明，内毒素不仅可以直接造成组织损伤，更重要的是还能激活内生致热原细胞产生和释放EP引起体温的升高[3]。EP指的是多种致热性细胞因子，在发热中起着十分重要的作用[4]。IL-6在炎症期间能引起发热，它有序地产生，有规律地释放[5],由IL-1β诱导，能通过血流经血脑屏障到达大脑。IL-1β是参与多种致热原性发热的重要细胞因子[6],它可以激活脑内皮细胞产生前列腺素E2(PGE2)、IL-6等介导下丘脑视前区的发热，还可刺激下丘脑合成、释放可引起动物体温明显升高的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH),也能直接入脑，作用于下丘脑的体温调定点引起发热[7]。

TNF-α是一种内生致热原[8]，可直接刺激体温调节中枢或间接诱导巨噬细胞分泌大量IL-1引起发热[9]，还可以使下丘脑组织中诱导发热的中枢介质PGE2明显增多。

中医学认为正气存内，邪不可干，这里的正气包括了免疫功能在内的一切抗病能力。免疫细胞及其亚群的计数、活性的测定以及细胞因子的检测等是衡量机体免疫功能的重要技术指标。

本实验研究结果显示：模型组TNF-α、ET、IL-1β、IL-6、CD8+明显升高，CD4+水平与CD4+/CD8+比值显著下降，说明内毒素可以导致激活内生致热原细胞产生和释放EP引起体温的升高并导致家兔免疫功能下降。白虎汤高、低剂量组均能明显抑制血清中TNF-α、ET、IL-1β、IL-6的含量升高(P<0.01)，提升CD4+水平与CD4+/CD8+比值(P<0.01)，降低CD8+水平(P<0.01)，说明白虎汤是通过减少TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，清除ET，调节机体免疫功能来达到解热效应的。

本实验研究结果表明，白虎汤对内毒素致热家兔有良好的解热作用，其机制可能是通过抑制发热家兔致热性细胞因子的释放，调节机体免疫功能而发挥其解热的作用。

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