玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤的保护作用研究

玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤的保护作用研究

刘冠璋1，董婉茹1，于卉1，高鑫1，李自辉1，刘树民1,2*

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.教育部北药基础与应用研究重点实验室，哈尔滨 150040)

摘要：目的研究玄参水提物对四氯化碳(CCL4)所致大鼠急性肝损伤的保护作用及其作用机制。方法40只SD雄性大鼠随机分为空白组，CCL4模型组，联苯双酯组，玄参水提物高，低剂量组。高、低剂量给药组大鼠分别给予5.4，1.35 g/kg玄参水提取液灌胃，联苯双酯组大鼠给予0.2 g/kg混悬液灌胃,空白组及模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药后1 h,除空白组腹腔注射10 mL/kg橄榄油外，其余各组按10 mL/kg剂量腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液。腹腔注射CCL4后，禁食不禁水,24 h后称重20%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血,并迅速摘取肝组织，观察比较各组大鼠肝组织病理学变化及部分肝功能指标的差异。结果玄参水提物能明显降低肝损伤大鼠肝脏指数、ALT、AST活性及MDA含量,并且增强SOD和GSH-Px活性，同时对血清中TBiL活性具有一定的降低作用。结论玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。

关键词：玄参水提物；四氯化碳；肝损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.022

中图分类号：R575文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)05-0504-04

基金项目:国家重点基础研究发展计划“973计划”(2013CB531804)；黑龙江省高等学校科技创新团队——研究方向中药药性理论研究。

作者简介:刘冠璋(1990-)，男，硕士研究生，主要从事中药药性理论方面的研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-12-31)

*通信作者:刘树民，电话-(0451)82193278，电子信箱-keji-liu@163.com

Laria ningpoensis Hemsl.for CCL4-induced liver injury in rats

LIU Guanzhang1,DONG Wanru1,YU Hui1,GAO Xin1,LI Zihui1,LIU Shumin1,2*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;

2.Key Laboratory of North Medicine Basic and Applied Research,Ministry of Education,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveA study on the protective effect and the mechanism of aqueous extract of the Radix Scrophulariae for CCL4-induced liver injury in rats.Methods40 male SD rats were randomly divided into blank group,model group,bifendate pills group,high dose group and low dose group.The high and low dose groups were administered intragastrically with 5.4,1.35 g/kg,bifendate pills group were administered intragastrically with 0.2 g/kg suspension.While rats in the blank

and model groups were given the same volume normal saline,once a day for 7 days.One hour after the last administration,except for the blank group with olive oil solution 10 mL/kg,rats in the other groups were given 10% CCL4olive oil solution 10 mL/kg by intraperitoneal injection.After i.p.administration,forbid food but not water,weighing after 24 h,rats in all groups were anaesthetized with 20% urethane and the blood samples were obtained from abdonminal aorta,and samples of liver tissues were harvested rapidly.Observe and compared the changes of liver tissues pathology and the difference of partial liver function indices.ResultsQueous extract of the Radix Scrophulariae significantly decreased the liver index,the activities of ALT,AST and the content of MDA,increased the activities of SOD,GSH-Px,meanwhile,decreased the activities of TBiL in serum to some extent.ConclusionQueous extract of the Radix Scrophulariae has a significant protection effect on the liver injury induced by CCL4in rats.

Keywords:aqueous extract of the Radix Scrophulariae;carbon tetrachloride;liver injury;malondialdehyde;superoxide dismutase

玄参为玄参科植物玄参(ScrophuLarianingpoensisHemsl.)的干燥根，始载于《神农本草经》[1]，列为中品，味甘、苦、咸，性微寒，归肺、胃、肾经。我国江南大部均有产出，其中以浙江出产的玄参为道地药材，称“浙玄参”。中药玄参的化学成分主要为环烯醚萜类、苯丙素苷类、芳香糖苷类等[2]。主要功效为凉血滋阴，泻火解毒。临床上常用其“清血分、营分之邪热”治疗温病热入营血，阴虚内热等证。另有记载玄参能够“泄肝阳”“滋肝木……明目”，中医临床上常用其养阴解毒的功效治疗肝炎[3]。但是现代临床并未将玄参治疗肝脏疾病的作用作为其主要的临床用途，故而本实验试图通过CCL4建立大鼠急性肝损伤模型来初步探讨中药玄参对肝损伤的保护作用及其作用机制。

1实验材料

1.1仪器GLAMOUR 2000全自动生化分析仪(北京华士信医疗设备有限公司)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，HHS型数显恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，UVmini-1240紫外-可见分光光度计(岛津国际贸易上海有限公司)，KDC-160HR台式高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)，LEICA RM2255病理切片机(北京中仪光科科技发展有限公司)，玻璃匀浆器。

1.2药材与试剂玄参饮片购自黑龙江省药材公司(批号:20120623012)，经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为玄参科植物玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根。联苯双酯由浙江万邦药业股份有限公司生产(产品批号：20140204)。橄榄油购于哈尔滨海浪科技有限公司。考马斯亮蓝蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒均购自南京市建成生物工程研究所。实验中所用其他试剂均为国产分析纯。

1.3实验动物SD大鼠40只，SPF级，雄性，体质量(240±20) g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(黑)2013-004。适应性喂养3 d后进行实验，所有实验大鼠的使用和喂养严格遵照动物保护协会所规定的有关条款。

2实验方法

2.1药物的制备玄参干燥根经适量粉碎后，等量分为6份，每份600 g。一煎10倍量水，二煎8倍量水，分别加热回流提取各1.5 h，合并两煎药液，于低温干燥机中冻干，得到6批质地如羽毛状轻软、棕黄色的玄参冻干粉末(出膏率：49.76%)。

2.2实验分组及处置实验动物适应性喂养3 d后随机分为5组，每组8只，即:空白组，CCL4模型组，联苯双酯组，玄参水提物高、低剂量组。各组均在每日9：00-10：00按照10 mL/kg(体质量)灌胃给予相应的试剂，连续7 d，1次/d。其中玄参水提物高、低剂量给药组大鼠分别给予5.4,1.35 g/kg玄参水提取液，联苯双酯组大鼠给予0.2 g/kg混悬液，空白组及CCL4模型组大鼠给予等体积生理盐水。于末次给药1 h后,除空白组腹腔注射10 mL/kg橄榄油外，其余各组按10 mL/kg剂量腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液。腹腔注射CCL4后,各组均禁食不禁水，24 h后称重,20%乌拉坦麻醉，由腹主动脉取血，并迅速摘取肝组织留存备检。

2.3血清及肝脏生化指标的测定取血后，室温静置20 min，4 ℃，4 000 r/min离心10 min取上清液，于-80 ℃低温保存用于ALT，AST，TBiL生化指标测定。用冷生理盐水尽可能去除肝脏残留的血，滤纸吸干后称重，计算肝脏指数。肝脏指数=肝质量/体质量×100%。同一肝小叶上取1.00 g肝组织加9倍量冷生理盐水于冰水浴上手动匀浆制备10%肝组织匀浆,4 ℃,3 500 r/min离心10 min取上清用于肝组织中MDA，SOD，GSH-PX的测定，具体操作按试剂盒说明书进行。剩余肝脏10%甲醛固定,送黑龙江中医药大学附属第一医院病理科做组织切片，进行HE染色，在光镜下观察肝组织病理学变化。

3实验结果

3.1玄参水提物对急性肝损伤大鼠肝脏指数的影响与空白组比较，CCL4模型组肝脏指数显著性升高(P<0.01)，说明CCL4可引起肝组织明显肿大；与CCL4模型组比较,玄参水提物高、低剂量组肝脏指数均显著性降低(P<0.01或P<0.05)；与联苯双酯组比较，玄参水提物高剂量组肝脏指数差异无统计学意义，低剂量组肝脏指数虽有降低趋势，但差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明,玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤肝脏指数具有改善作用，且高剂量组更为明显。结果见表1。

组别剂量/(g/kg)肝脏指数/%空白组 —3.04±0.10 CCL4模型组 —4.46±0.41▲▲ 联苯双酯组 0.23.40±0.20## 玄参水提物低剂量组1.353.99±0.32#△△玄参水提物高剂量组5.43.54±0.22##

注：与CCL4模型组比较，#P<0.05，##P<0.01;与联苯双酯组比较，△△P<0.01；与空白组比较，▲▲P<0.01

3.2玄参水提物对急性肝损伤大鼠血清ALT、AST及TBiL活性的影响与空白组比较,CCL4模型组大鼠血清中ALT、AST及TBiL显著性升高(P<0.01)，说明CCL4造模成功；与CCL4模型组比较，玄参水提物高、低剂量组大鼠血清中ALT、 AST均显著性降低(P<0.01)，玄参水提物高、低剂量组大鼠血清中TBiL虽有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与联苯双酯组比较，玄参水提物高剂量组大鼠血清中ALT、AST差异无统计学意义,低剂量组大鼠血清中ALT、AST差异具有统计学意义(P<0.05)，但仍有降低趋势，各组大鼠血清中TBiL均无显著性差异。结果表明，玄参水提物对急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST具有降低作用，且高剂量组效果更好。结果见表2。

表2　玄参水提物对CCL 4 所致大鼠急性肝损伤血清ALT、AST、TBiL的影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与CCL4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与联苯双酯组比较，▲P<0.05

3.3玄参水提物对急性肝损伤大鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响与空白组比较，CCL4模型组大鼠肝脏中SOD活性显著性降低(P<0.01)，MDA含量显著性升高(P<0.01)，GSH-Px活性明显降低(P<0.05)；与CCL4模型组比较，玄参水提物高剂量组SOD活性显著性升高，MDA含量显著性降低(P<0.01)，玄参水提物低剂量组SOD活性显著性升高(P<0.01),GSH-Px活性明显升高(P<0.05)；与联苯双酯组比较，玄参水提物高剂量组大鼠肝脏中SOD、GSH-Px活性及MDA含量差异均无统计学意义,低剂量组大鼠肝脏中SOD、GSH-Px活性差异无统计学意义,MDA含量降低趋势不明显(P<0.05)。结果表明,玄参水提物对急性肝损伤大鼠肝脏中SOD、GSH-Px活性及MDA含量具有改善作用。结果见表3。

表3　玄参水提物对CCL 4所致大鼠急性肝损伤肝脏中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与CCL4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与联苯双酯组比较，▲P<0.05

3.4大鼠肝组织病理学研究

3.4.1肉眼观察空白组大鼠肝脏显红褐色，质软而脆，边缘圆顿,各肝小叶间无黏连。CCL4模型组大鼠肝脏有呈暗红色或有呈黄褐色，质地较韧，体积较大，表面附有苍白色黏膜，与周围脏器黏连较严重，并伴有点状坏死区域。玄参水提物低剂量组肝脏颜色偏暗，轻微质韧，存在斑点斑块。联苯双酯组和玄参水提物高剂量组肝脏形态介于空白组和玄参水提物低剂量组之间。

3.4.2光镜观察与空白组比较,CCL4模型组大鼠肝细胞大面积的空泡性坏死，小叶间动静脉充血，肝小叶结构严重被破坏，汇管区及小叶内炎性细胞浸润。联苯双酯组肝细胞中度的空泡性坏死，窦状隙内有较多的红细胞，血管周围少量炎性细胞浸润，对CCL4所致大鼠急性肝损伤几乎无保护作用。玄参水提物低剂量组情况皆差于联苯双酯组。玄参水提物高剂量组肝细胞发生轻度空泡性变形红染，中央静脉周围充血减轻，肝小叶结构清楚，血管周围少量炎性细胞浸润，肝组织病变明显减轻。表明玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，且高剂量组效果更好。

4结论

肝损伤是多因素参与的复杂过程，如改变质膜的完整性、细胞内离子浓度变化、自由基的作用、免疫变态反应等都可引起肝损伤[4]。

动物的肝脏指数与肝损伤呈正相关关系,是反映肝脏受损程度的客观指标[5]。血清中ALT和AST含量在一定程度上反映了肝细胞受损程度，是反映肝损伤的敏感且最常用的指标[6]。当肝脏受损时，由于肝脏处理及排泄间接胆红素功能障碍，致使血液中的TBiL含量升高[7]。MDA是重要的脂质过氧化产物，MDA的含量可反映组织过氧化损伤程度，间接反映细胞的损伤情况[8]。SOD为高效的清道夫,可抑制自由基启动的脂质过氧化，GSH-Px特异地催化还原性GSH对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构与功能完整的作用[9]。SOD与GSH-Px不仅在活性上能协同作用，还能组成相互保护的防御群，更有效的清除机体内自由基，保护细胞免遭氧化损伤，维持体内代谢平衡[10]。

现代研究发现，玄参的氯仿粗提物极其所含的单体化合物，对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝损伤均有较好的保护作用[11]。玄参中苯丙素苷对于受损肝细胞能明显提高其存活率，降低肝衰竭大鼠的AST、ALT水平，对肝细胞损伤有较好的保护作用[12]。本实验进一步验证了传统意义上玄参水煎煮液对CCL4所致大鼠急性肝损伤的保护作用。结果表明，玄参水提物对CCL4所致大鼠急性肝损伤具有明显的保护作用,能显著降低肝损伤大鼠肝脏指数、ALT、AST活性及MDA含量，并且增强SOD和GSH-PX活性，同时对血清中TBiL活性具有一定的降低作用，其机制可能与阻止肝脏抗氧化酶活性降低，提高肝细胞清除自由基能力及抗脂质过氧化作用相关，但其保肝活性成分及更深入的作用机制还有待进一步研究。

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