产纤维素酶芽孢杆菌的筛选及鉴定

■张璐璐 卫旭彪 斯大勇 郑召君 马 广 张日俊

（中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室，北京100193）

我国是世界上生产和消费玉米、大豆的大国，2013年中国玉米产量达到21 500万吨以上，大豆消费量约为7 118万吨。玉米纤维和豆渣是玉米和大豆在加工过程中产生的副产物。玉米纤维和豆渣由于理化性质的特殊性，因而它们作为动物饲料有很多的限制。近年来，国内外对玉米纤维和豆渣如何高质化利用进行了大量研究，常用的方法主要有物理法、化学法、物理化学法和生物法。但是，现在产业中处理玉米纤维和豆渣采用的强烈溶剂法处理，几乎会导致玉米纤维中100%水溶性纤维、50%～60%半纤维素和10%～30%纤维素溶解，从而造成营养物质的极大损失[1]。同样，采用物理方法对粮食加工副产物处理也造成营养物质的极大损失。每年我国面对庞大的粮食加工副产物的现实，采用微生物处理是最好的选择。芽孢杆菌在食品和工业领域已经安全运用多年，其对营养要求不高，具有较强的产酶能力，易于分离、培养，抗逆性强。动物饲料中运用产酶的菌株较多的是芽孢杆菌。目前，已经发现一些产纤维素酶能力较强的芽孢杆菌。梁艳玲(2014)[2]从生境中筛选出一株地类芽孢杆菌ME27-1，在液体培养基中培养60 h后，其CMC酶酶活为0.17 U/ml。陈珊等(2014)[3]从长白山森林土壤中筛到一株地衣芽孢杆菌，在液体培养基中发酵48 h后，其CMC酶酶活为1.82 U/ml。Abdullah等（2014）[4]利用物理和化学诱变得到一株CMC酶最大酶活为1 250 U/ml的芽孢杆菌N3。Gaur等（2015）[5]从土壤中分离到一株纤维素酶最大酶活为4 105 U/ml的芽孢杆菌RG-07。本试验根据芽孢杆菌能产芽孢、抗逆性强和产酶量大的特性，从土壤、牛瘤胃液、马粪便、牛粪便和实验室保藏菌种等生境中筛选出一株高产纤维素酶的芽孢杆菌，并进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤、腐木、腐叶、牛瘤胃液、马粪便、鸡盲肠和结肠内容物、青贮饲料、牛粪便、纳豆和实验室保藏菌种由中国农业大学饲料生物技术试验室提供。

1.2 培养基及主要试剂配制

NA培养基、NB培养基、种子培养基(葡萄糖6 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g，蒸馏水500 ml,18%的 Na2CO3500 ml，pH值6.8)、纤维素酶液体发酵培养基(玉米粉20 g、玉米纤维20 g、干豆渣30 g、牛肉膏3 g、蛋白胨2 g、NaCl 5 g、MgSO40.5 g、Na2HPO41 g、KH2PO41 g，蒸馏水1 000 ml，pH值6.8，0.5%的CMC-Na)、刚果红CNC-Na平板、淀粉平板、酪蛋白平板、CMC-Na培养基、pH值4.8乙酸缓冲液、DNS试剂、10 mg/ml的木糖标准贮备液、10 mg/ml的葡萄糖标准贮备液。

1.3 产纤维素酶芽孢杆菌的分离筛选

1.3.1 芽孢杆菌富集

取2 g或2 ml新鲜样品，加入盛有18 ml无菌生理盐水的三角瓶中，振荡2～3 min混匀，静置2 h，吸取5 ml上清液，加入无菌试管中，然后80℃水浴20 min。按10%接种量将水浴后菌液接种到NB培养基中，180 r/min、37℃摇床富集24 h。

1.3.2 芽孢杆菌分离

对富集后的培养液进行梯度稀释，选取10-4、10-5、10-6梯度在NA培养基上涂布，每个稀释度3个平行，37℃培养24 h得到单菌落，根据菌落形态和革兰氏染色镜检，挑取单菌落进行NA斜面保存。

1.3.3 产纤维素酶芽孢杆菌初筛

采用平板划线法，从斜面上挑选菌株在刚果红CNC-Na平板上划线，37℃培养48 h，观察是否出现透明圈。挑选生长快、透明圈大的单菌落接种到NB培养基中，180 r/min、37℃摇床培养24 h后制成发酵种子液。用灭菌牙签蘸取少量菌液点种于CNC-Na平板上，37℃培养2～4 d，采用0.2%的刚果红染色30 min，用蒸馏水和1 mol/l NaCl依次洗去染液。测量透明圈和菌落直径并计算其比值，挑选比值较大的菌落进行复筛。

1.3.4 产纤维素酶芽孢杆菌的复筛

将筛到的产纤维素酶能力强的菌株在种子培养基培养24 h，以4%的接种量接种到装有100 ml纤维素酶液体发酵培养基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37℃摇床培养48 h后，在5 000 r/min的离心机上离心10 min，收集上清液即为待测粗酶液。测定所筛菌株的CMC酶酶活，筛选出产纤维素酶能力强的菌株。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学鉴定

观察目标菌株在NA平板上形成的菌落形态，革兰氏染色后在显微镜下观察菌体和芽孢形态。

1.4.2 分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取总DNA，利用设计引物P1和P2对gyrA基因片段进PCR扩增。正向引物 P1：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′，反向 引 物 P2：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。对所提芽孢杆菌DNA进行PCR扩增。采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA提取情况。将扩增后的基因送测序公司测序，并对所测的序列在GenBank数据库中进行比对以确定菌种。

1.5 产纤维素酶酶活测定

将筛到的菌群在种子培养基培养24 h，以4%的接种量接种到装有100 ml纤维素酶液体发酵培养基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37 ℃摇床培养48 h后，在5 000 r/min的离心机上离心10 min，收集上清液即为待测粗酶液。测定所筛菌株的纤维素内切葡聚糖酶酶活、外切葡聚糖酶和木聚糖酶酶活。

1.6 产淀粉酶及蛋白酶能力测定

用灭菌的牙签蘸取少量的菌液分别点种于淀粉平板和酪蛋白平板上，37℃培养48 h，直接观察酪蛋白平板的菌落周围是否出现透明圈，在淀粉平板表面滴加碘液观察是否出现水解圈。

1.7 模拟胃液试验

取1 mol/l的盐酸加水稀释至pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，每个pH值样品分别取30 ml至100 ml三角瓶中121℃灭菌20 min，冷却至室温，用滤菌器向每个三角瓶中加入0.5 g胃蛋白酶，摇匀后待用，将培养 12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分别测定解淀粉芽孢杆菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并计算相对含量。

1.8 模拟肠液试验

将A液（A胰腺液：称取 1.1 g碳酸氢钠，0.85 g氯化钠加入100 ml蒸馏水中，用氢氧化钠调pH值至6.8，121℃灭菌20 min，冷却后，无菌操作下加入1.5 g胰蛋白酶混合备用）和B液（B胆液：称取1.2 g牛磺酸胆盐加入至100 ml蒸馏水中，121℃灭菌20 min。冷却备用）以2∶1体积混合即可得到人工肠液，每个三角瓶取100 ml人工肠液，放置待用。将培养12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分别测定解淀粉芽孢杆菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并计算相对含量。

1.9 抑菌能力测定

图1 在纤维素平板上的水解圈

将金黄色葡萄球菌接种于BPY液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养12 h，稀释活菌数为106CFU/ml，取100 μl涂布于BPY平板。将待测解淀粉芽孢杆菌B13培养24 h后12 000 r/min离心10 min，取200 μl上清液加入牛津杯中，37℃培养12 h，观察是否出现抑菌圈。

2 结果与讨论

2.1 产纤维素酶芽孢杆菌筛选

刚果红染色是最简单且被广泛用于产纤维素酶菌株筛选。本试验从25个样品中分离到28株能够产纤维素酶的芽孢杆菌（见图1）。对筛到的28株菌进行CMC-Na平板筛选，并测量计算菌落直径、透明圈直径、透明圈直径与菌落直径的比值(见表1)。选取透明圈直径与菌落直径比值较大或水解圈较大的菌株进行纤维素内切葡聚糖酶活力测定(见表2)。由表2可知，菌株B13内切葡聚糖酶酶活最高为7.31 U/ml，选定此菌株为目标菌株。

表1 产纤维素酶芽孢杆菌的初筛

表2 产纤维素酶芽孢杆菌的复筛(U/ml)

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态学鉴定

芽孢杆菌在NA平板上呈乳白色、圆形、褶皱、边缘整齐的菌落(见图2)。镜检菌株为革兰氏阳性菌，菌体为杆状，两端钝圆，单个或成对排列，芽孢端生。

图2 芽孢杆菌B13菌落形态（左）及革兰氏染色（右）

2.2.2 分子生物学鉴定

16S rDNA/RNA基因序列虽然被广泛应用于细菌的鉴定和细菌的系统进化关系构建，但是其不能用于序列相似度很高的枯草杆菌群的类群间分类[6-7]。gyrA是一段高度保守的基因片段，利用gyrA基因能够有效地区分枯草芽孢杆菌组中的近缘种[8]。本试验采用gyrA序列对所筛到的目标菌株B13的基因序列进行分析，在GenBank中对其扩增产物的序列进行比对发现，所筛的B13菌株序列片段与GenBank中解淀粉芽孢杆菌的序列片段相似性达99%，从而鉴定其为解淀粉芽孢杆菌。

2.3 产纤维素酶酶活测定

解淀粉芽孢杆菌B13经液态发酵后，其纤维素内切葡聚糖酶酶活为7.31 U/ml的菌株B13作为目标菌株，并测定其纤维素外切葡聚糖酶酶活为5.26 U/ml，木聚糖酶酶活为32.46 U/ml。

图3 解淀粉芽孢杆菌B13在淀粉平板上的水解圈(左)及在酪蛋白平板上的水解圈（右）

2.4 产淀粉酶及蛋白酶检测

把芽孢杆菌接种到淀粉平板和酪蛋白平板，发现所筛目标菌株能够产淀粉酶(见图3左)和蛋白酶(见图3右)。

2.5 模拟胃液试验

动物胃中较低的pH值能够杀死大部分微生物[9]，然而芽孢杆菌作为益生菌能够产生芽孢，有一定的抗逆性。本试验测定了筛选到的解淀粉芽孢杆菌B13在不同pH值模拟胃液下，作用不同时间，解淀粉芽孢杆菌B13的相对存活率，结果见表3。由表3可知，该芽孢杆菌对模拟胃液有一定的耐受性；当pH值≥2.0时，处理1 h该芽孢杆菌不但不致死，而且还能生长，但处理时间超过1 h后该芽孢杆菌的相对存活率逐渐下降；pH值1.5对该菌影响较大，在此pH值下处理4 h其相对存活率为65.4%。

表3 解淀粉芽孢杆菌B13耐模拟胃液试验结果(%)

2.6 模拟肠液试验

动物肠道中存在大量的微生物，也是益生菌发挥作用的主要场所[10]。小肠偏碱性有利于芽孢杆菌的生长，然而，小肠中存在大量的酶及胆盐，不利于芽孢杆菌的生长[11-12]。本试验测定了解筛选到的解淀粉芽孢杆菌B13在模拟肠液中作用不同时间芽孢杆菌B13的相对存活率，结果见图4。由图4可知，该芽孢杆菌对模拟肠液的耐受性较弱，该菌的相对存活率随着时间逐渐降低；模拟肠液处理2 h，该株芽孢杆菌相对存活率为56.6%，处理1 h，该株芽孢杆菌相对存活率为84.8%。

图4 解淀粉芽孢杆菌B13模拟肠液试验结果

2.7 抑菌能力试验

取芽孢杆菌培养物的上清液，进行牛津杯37℃培养12 h后，发现未出现透明圈（见图5），即该芽孢杆菌未能产生抗金黄色葡萄球菌的物质。

图5 解淀粉芽孢杆菌B13抑菌试验

3 结论

通过初筛和复筛，本试验从生境中分离到一株产纤维素酶能力强的芽孢杆菌B13，对B13菌株进行形态学和分子生物学鉴定后，确定为解淀粉芽孢杆菌。其中纤维素内切葡聚糖酶酶活为7.31 U/ml，纤维素外切葡聚糖酶酶活为5.26 U/ml，木聚糖酶酶活为32.46 U/ml。此菌株能够产淀粉酶和蛋白酶，并且对模拟胃液有很高的耐受性，对模拟肠液有一定的耐受性。在模拟胃液试验中，在对该菌影响最大pH值1.5条件下，处理4 h其相对存活率为65.4%；该菌在模拟肠液中，处理1 h，该株芽孢杆菌相对活菌数是84.8%，处理2 h，该株芽孢杆菌相对活菌数为56.6%。该菌对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。