利用肉鸡测定米曲霉发酵的非常规蛋白质饲料中营养物质代谢率

■王国强 王朋朋 刘超齐 常 娟 尹清强 王二柱 卢富山

（1.南阳农业职业学院，河南南阳473000；2.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；

3

.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡453000；4.河南省饲料微生物工程技术研究中心，河南周口466000）

随着我国畜牧业与饲料工业迅猛发展，对饲料原料特别是蛋白质原料的需求量急增，蛋白质饲料原料的紧缺，已成为我国畜牧业发展的瓶颈。研究开发新的蛋白质饲料资源，对我国畜牧业的发展将起到举足轻重的作用。我国非常规蛋白质饲料资源丰富，但消化、吸收和利用率低，例如血粉、羽毛粉中蛋白质消化利用率仅30%左右，棉籽粕(饼)和菜籽饼(粕)等蛋白质饲料中含有毒素和抗营养因子，严重地影响了其在畜禽饲料中大量使用。因此，如何提高非常规蛋白质饲料的营养价值及消化利用率，已成很多学者研究的课题。

许多研究证实，利用微生物发酵技术，能提高低品质蛋白质饲料的营养价值，并消除其中的毒素和抗营养因子，从而缓解我国蛋白饲料资源的不足。同时，通过微生物发酵，可产生大量的酶类和其它生物活性物质，大量的益生菌，有提高饲料中营养物质及调节动物胃肠道微生物区系平衡的作用。微生物发酵包括细菌和真菌发酵两种类型，真菌能分泌较多的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等，对提高非常规蛋白质饲料的营养价值效果显著。本研究用本研究室保存的产蛋白酶活性较强的米曲霉为发酵菌种，用血粉、羽毛粉和棉粕为蛋白质原料，采用固态发酵的方式制备代谢率高的复合蛋白质饲料，利用肉鸡的代谢试验测定发酵蛋白质饲料的营养价值，为非常规蛋白质饲料资源的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 微生物发酵复合蛋白质原料的制备

本研究选用的米曲霉是河南农业大学动物营养与生物技术研究室从牛的瘤胃中分离出来，经23S rRNA鉴定后保存备用。综合本研究室以前微生物发酵试验结果，确定了米曲霉发酵复合蛋白质原料的最佳配方是：麦麸35%、棉粕26%、羽毛粉4%、玉米粉5%、血粉30%；合适的发酵工艺条件：初始pH值为6、含水率50%、接种量为2%（米曲霉制成孢子浓度为1×109个/ml，）、最佳收获时间为60 h；在上述工艺条件下，发酵产品中可溶性蛋白质的含量是173.72 mg/g，氨基氮的含量是34.75 mg/g，游离氨基酸的总量是100.945 mg/g，粗蛋白质的含量是48.97%；蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性分别为2 341.83、36 780.8 U/g和6 835.43 U/g。

1.2 试验设计及日粮组成

选择7周龄AA肉鸡25只（要求健康无病、个体重相近，单笼饲养），随机分为5个试验组、每个试验组5个重复，每个重复1只鸡。试验Ⅰ组（对照组）基础日粮为玉米-豆粕型，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别用发酵蛋白质原料代替基础日粮中90%、60%和30%豆粕，试验Ⅴ组用未发酵蛋白质原料代替基础日粮中60%豆粕（试验日粮组成及营养水平见表1）。

表1 试验日粮组成及营养水平

1.3 营养物质代谢率的测定

代谢试验利用全收粪法，预试期7 d，正试期3 d，采食量限制，自由饮水、自然光照，正试期每天准确记录每只鸡的采食量，每天收集每只鸡的排泄物1次，并适量喷洒10%硫酸，置冰箱存放，持续3 d后，将每只鸡3 d的排泄物混合均匀，置于平皿中，在70℃温度条件下烘干后称重，粉碎过40目筛后留样备用。使用常规方法来测定饲料与粪样中粗脂肪（GB/T 6434—1994）、粗蛋白（GB/T 6432—1994）、钙（GB/T 6436—1994）和磷（GB/T 6437—1994）的含量，用下列公式进行计算。

营养物质表观代谢率（%）=（摄入养分量-排泄物中养分量）/摄入养分量×100。

1.4 微生物培养基的制备及胃肠道微生物区系和酶活分析

在正试期结束后，每组随机选3只鸡屠宰，快速打开腹腔，在无菌的条件下，采集大小肠两部位的内容物，利用生理盐水（稀释大肠杆菌用）或MRS培养液(稀释乳酸菌用)稀释粪便中的微生物至1×10-8左右，采用涂板计数法测定肠道中米曲霉（PDA培养基）、乳酸菌（MRS培养基）、大肠杆菌（伊红美蓝培养基）的数量。微生物的数量利用对数值（lg）计算，并用每克肠道内容物中的菌落形成数表示（cfu/g）。用Folin-酚法和Yoo改良法分别测定肉鸡小肠内容物蛋白酶与淀粉酶的活性。

培养米曲霉的PDA培养基：可溶性淀粉6 g、酵母 2 g、蛋白胨5 g、葡萄糖 20 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.5～7.0，在121℃和1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌15 min，制备固态平皿培养基备用。鸡内容物的稀释液接种后在30℃下静置培养48 h，统计米曲霉的数量。

培养乳酸菌的MRS培养基制备：胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母5 g、葡萄糖20 g、柠檬酸三铵2 g、乙酸钠5 g、吐温80 1 ml、硫酸镁200 mg、硫酸锰50 mg、磷酸氢二钠2 g，pH值6.2～6.6,用蒸馏水溶解配至1 000 ml，高压灭菌后备用。制备MRS固态厌氧培养基的流程为：将60 mg琼脂粉放入Hungate厌氧管内，加入MRS培养液3 ml，用CO2排出管内的空气，密封厌氧管,高压灭菌，取出后放入50℃水浴锅内备用。取100 μl鸡内容物的稀释液，接种于厌氧管后，快速在冰上旋转，在37℃下静置培养48 h后，统计乳酸菌的数量。

鉴别大肠杆菌的伊红美兰培养基的组成：蛋白胨 20 g、猪胆盐5 g、乳糖5 g、琼脂粉20 g、0.4%溴甲酚紫水溶液2.5 ml，蒸馏水1 000 ml，pH值7.4。高压灭菌15 min后，制备固态平皿培养基备用。鸡内容物的稀释液接种后在37℃下静置培养48 h，统计大肠杆菌的数量。

1.5 数据的统计分析

采用SAS 8.2统计软件对所有数据进行统计分析和显著性检验，试验结果用“平均值±标准差”来表示，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵蛋白产品对肉鸡日粮营养物质代谢率的影响（见表2）

表2 发酵蛋白产品对肉鸡日粮养分代谢率的影响(%)

表2的结果显示，消化率低的蛋白质饲料通过微生物发酵后，其粗蛋白质、钙和总磷的代谢率显著高于未发酵的蛋白质组（P＜0.05）（试验Ⅱ组除外），尤其是以30%和60%豆粕替代组效果最好，与对照组无显著性差异（P＞0.05），然而对粗脂肪的代谢率无显著性影响（P＞0.05）。说明在肉鸡日粮中用30%～60%发酵蛋白来替代豆粕是可行的。

2.2 发酵蛋白产品对肉鸡肠道菌群的影响（见表3）

表3 发酵蛋白产品对肉鸡直肠中微生物菌群的影响（lg cfu/g)

从表3可以看出，肉鸡通过饲喂微生物发酵蛋白的三种日粮后，其直肠中米曲霉数量显著高于对照组与试验Ⅴ组（P＜0.05）；乳酸菌数量与对照组相近，但显著地高于未发酵蛋白质组（P＜0.05）。只有30%和60%豆粕替代组肉鸡直肠中的大肠杆菌数量显著地低于其它三组（P＜0.05）。

2.3 发酵蛋白产品对肉鸡小肠中消化酶活性的影响（见表4）

表4 发酵蛋白产品对肉鸡小肠中消化酶活性的影响（U/g)

表4结果表明，三个发酵蛋白质组与对照组和未发酵蛋白质组相比，显著地提高了肉鸡小肠中蛋白酶和淀粉酶的活性（P＜0.05）；对照组肉鸡小肠中蛋白酶和淀粉酶的活性显著地高于未发酵蛋白质组（P＜0.05），这说明未发酵蛋白质对肉鸡小肠中蛋白酶和淀粉酶的分泌有明显的影响。

3 讨论

3.1 发酵蛋白对肉鸡营养物质表观代谢率的影响

蛋白质饲料经过微生物发酵处理后，其理化性质得到明显改变，很好地解决了低品质蛋白质饲料原料营养成分少、适口性差且含有抗营养因子和毒素等缺陷；同时，在发酵过程中，会产生许多小分子多肽和氨基酸，更有利于动物的消化吸收，营养物质代谢率得到显著提高。何涛（2008）的研究结果说明，棉粕发酵后，在基础日粮中代替20%豆粕时，肉仔鸡的表观蛋白质代谢率与对照组相比，差异不显著；杨远新等（2006）的研究表明，血粉发酵后，在基础日粮中代替豆粕时，能明显提高蛋白质的代谢率、氮沉积量、氮沉积率等，与本试验研究的结果趋于一致。本研究表明，在肉鸡基础日粮中，使用30%～60%发酵复合蛋白质原料代替豆粕，各种营养物质的表观代谢率与对照组相比差异不大，但当替代率达90%时，显著地降低日粮中营养物质的利用率。分析其原因可能是微生物发酵，不能彻底降解原料中的抗营养因子与大分子蛋白质；同时，添加量越大，抗营养因子和不易消化吸收的蛋白质在日粮中的含量就越高，从而影响了肉鸡日粮中各种营养物质的消化吸收率。

本研究证明，与未发酵蛋白质组相比较，发酵复合蛋白质组能提高各种营养物质的代谢率，究其原因主要是未经发酵复合蛋白中含有很多的有毒物质、抗营养因子和不易被消化吸收的大分子蛋白质；而发酵复合蛋白产品中的这些物质，通过微生物的发酵和酶解，数量明显降低，进而提高了各种营养物质的代谢率。

3.2 发酵蛋白对肉鸡肠道微生物菌群和消化酶活性的影响

动物消化道中存在大量的有益与无益微生物，在正常情况下，有益菌与无益菌之间相互作用，与动物存在着共生关系，参与机体内营养物质的消化、吸收转化、分解、代谢和合成等；同时，日粮中的营养成分与含量的变化对消化道中微生物菌群的数量有很明显的影响。大量研究结果表明，畜禽饲料中添加适量微生物发酵饲料和益生菌产品，能显著提高其消化道内乳酸菌的数量，从而抑制大肠杆菌的生长繁殖。何涛（2008）的研究结果证明，用微生物发酵棉粕代替日粮中部分豆粕，可调控肉用仔鸡消化道中的微生态平衡，增加了有益菌群特别是乳酸菌的数量，抑制了大肠杆菌生长繁殖，从而减少了大肠杆菌的数量。赵江涛（2007）研究结果表明，在肉鸡日粮中，用米曲霉固体发酵物按0.1%的量添加，可以使大肠杆菌的数量明显降低，乳酸菌的数量显著提高，而且米曲霉在肠道内能大量定植，取得了与本研究结论趋于一致的结果。分析其原因，主要是米曲霉在对蛋白质原料的发酵过程中，产生大量的活孢子能在肠道内生长与繁殖，所以在直肠内能检测出许多米曲霉；另外，蛋白质原料经过米曲霉的发酵，还能生产大量的酶、代谢产物及一些生长因子等，从而增殖了肠道中乳酸菌等有益菌的数量，抑制大肠杆菌等有害菌的生长和繁殖。

3.3 发酵蛋白对肉鸡肠道消化酶活性的影响

本研究结果还表明，发酵复合蛋白添加到肉鸡日粮中，能显著地提高肉鸡小肠内蛋白酶和淀粉酶的活性，这一结果与发酵复合蛋白中含有一定数量的外源蛋白酶和淀粉酶有关，此试验结果与马文强等(2006)报道的结论基本一致。

4 结论

与未发酵蛋白质组相比较，肉鸡日粮中使用发酵复合蛋白替代30%～60%的豆粕，能显著提高日粮中各种营养物质的代谢率（P＜0.05）（粗脂肪除外），并能显著地提高肉鸡肠道中乳酸菌的数量和消化酶的活性（P＜0.05），抑制大肠杆菌在肉鸡肠道中生长繁殖，大肠杆菌的数量明显减少（P＜0.05），试验为非常规蛋白质饲料资源的开发利用提供参考。

（参考文献14篇，刊略，需者可函索）