根皮苷对LO2正常人肝细胞体外细胞毒性的实验研究

根皮苷对LO2正常人肝细胞体外细胞毒性的实验研究

陈署贤1,郭建茹2,朱冬梅3,刘华桢3,林继宗1,侯少贞3*

(1.中山大学附属第三医院肝病外科，广州 510630；2.澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078；

3.广州中医药大学中药学院，广州 510006)

摘要：目的探究根皮苷对正常人肝细胞LO2的体外细胞毒性。方法实验分为正常组和根皮苷组。将从甜茶中提取根皮苷配以不同浓度根皮苷的培养液，浓度分别为4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。分别在24、48和72 h，使用MTT比色法测定并计算出细胞活力率。结果给药24、48和72 h后，根皮苷在4.0～1 000 μmol/L浓度的范围内对正常人肝细胞LO2无毒性作用，细胞的存活率在90%以上。结论在4.0～1 000 μmol/L浓度范围内，根皮苷对正常人肝细胞的正常增殖无明显抑制，未显示有肝细胞毒性作用。

关键词：根皮苷；肝细胞；MTT

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.024

中图分类号：R285.5文献标志码： A

基金项目:国家自然科学基金(81303281)；广东省教育部产学研结合项目(2012B091100184)；广州中医药大学优秀青年学者科研基金项目(2012)。

作者简介:陈署贤(1981-)，男，硕士研究生，主治医师，主要从事脂肪肝的发展机制及治疗研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-11-07)

*通信作者:侯少贞,电子信箱-hsz0214@gzucm.edu.cn

Cytocoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells

CHEN Shuxian1,GUO Jianru2,ZHU Dongmei3,LIU Huazhen3,LIN Jizong1,HOU Shaozhen3*

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,The Third Affiliated Hospital of SUN YAT-SEN University,Guangzhou 510630,China;

2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Macau University of Science

and Technology,Macau 999078,China;

3.College of traditional Chinese Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the cytotoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells.MethodsThe normal group and Phlorizin groups with the concentrations of 4.0,8.0,16.0,32.0,64.0,128,256,512,800,1 000 μmol/L were established.Then the rate of cell viability was calculated by the MTT assay,respectively at 24 h,48 h and 72 h after administration.ResultsAfter administration for 24,48 and 72 hours,the absorbance of all Phlorizin groups were similar to that of normal group,and there were no statistical significance.The cell viability was all above 90%.ConclusionPhlorizin has no toxicity to normal human liver cells with the concentration range of 4.0-1 000 μmol/L.

Keywords:Phloridzin;LO2 human liver cells;MTT assay

根皮苷最早是从苹果、苹果树皮及叶中提取而得，属于二氢查耳酮化合物[1]。同时，根皮苷还广泛存在于多穗柯植物的叶中[2]。多穗柯，俗称“甜茶”，是南方地区一种作为保健茶的中药，其功效主要有清热解毒、滋肝补肾、生津润肺等，主要用于降低血糖、降血脂、降血压等[3-4]。考虑作为保健茶饮用，药材主要活性成分的安全性研究是一项必要的工作。经口化合物进入肠道被人体吸收后，一般主要在肝脏代谢，由此最容易也最早产生肝毒性作用[5]。根皮苷是甜茶的主要化学成分，目前尚未有关于其对肝细胞毒性的实验报道。本实验拟初步考察根皮苷对肝细胞的毒性作用，为甜茶及根皮苷的食用和治疗的安全性提供部分实验依据。

1实验材料

1.1细胞LO2细胞，为人肝细胞株，购于广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2药物根皮苷(Phloridzin)，由广州中医药大学新药开发研究中心提供，经HPLC检测结果显示，根皮苷纯度超过为96%。

1.3试剂及仪器改良型RPMI-1640培养基，Hyclone公司;青霉素-链霉素双抗液，上海慧颖生物科技有限公司;0.25%胰酶-EDTA，美国GIBCO公司；胎牛血清，美国GIBCO公司；MTT，Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)，天津市大茂化学试剂厂；CO-150型一氧化碳培养箱，美国NBS公司；SW-CJ-2F型医用净化工作台，苏州净化设备厂；CKX-41-32型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；CU600型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司；RT-2100C型酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司。

2实验方法

2.1试剂配制

2.1.1MTT的配制用精密天平称取0.25 g MTT，置于50 mL容量瓶中，加PBS适量，50～60 ℃水浴，摇匀使溶解充分，加PBS至刻度，配制成5 mg/kg的溶液，用0.22 μm的唯孔滤膜过滤除菌，分装后避光4 ℃冰箱保存。

2.1.2细胞冻存液的配制细胞冻存液按照20%血清、10%DMSO、70%1640培养基混合均匀，-20℃保存。

2.1.3根皮苷的配制用DMSO配成药物的母液，然后用培养液稀释到所用药物的浓度，DMSO的终浓度控制在≤0.1%。

2.2LO2细胞培养将人正常的LO2细胞放入25 cm2细胞培养瓶，加入含10%FBS的RPMI-1640培养液约4～5 mL，置37 ℃细胞培养箱中,5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。每2 d换1次培养液，每天观察细胞生长情况，细胞80%融合后进行传代或冻存。取5～7代细胞用于正式试验。

2.3分组与给药实验分为正常细胞对照组，根据预实验结果设置不同浓度根皮苷给药组，浓度分别为4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。

2.4肝细胞MTT比色取对数生长期LO2细胞，配成5.0×103个/mL的细胞悬液接种于96孔板，设置正常对照组，不同浓度4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L的根皮苷给药组。培养24 h后，吸弃培养液，用PBS洗2～3次,分别加入上述不同浓度的根皮苷，每个浓度设8个复孔，置37 ℃，5%CO2培养箱培养。培养24、48、72 h后，在各个时间段分别加入MTT溶液，避光培养4 h。4 h后，吸弃上层培养基，再每孔加入150 LDMSO溶剂溶解噻唑蓝结晶，轻摇培养板使溶解均匀。酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度值。每孔吸光值大小反应细胞数量的多少，两者呈正比。实验重复3次。

计算出细胞活力率:细胞活力率(%)=各组吸光度(OD490)×100/对照组吸光度(OD490)

3实验结果

不同浓度根皮苷在不同时间段内对细胞生长的影响结果见表1～3。实验数据结果显示，给药24 h后，不同浓度的根皮苷给药组与正常组的OD值相比较无统计学意义，细胞的存活率跟正常组细胞接近；给药48 h后，各组细胞OD值比24 h后的变大，提示细胞正常生长，不同浓度的根皮苷给药组的细胞正常生长，存活率大于90%，与正常组相比较无统计学意义;给药72 h后，各组细胞的OD值呈增长趋势，但增长率减小，提示细胞仍处于生长阶段，生长速度有所抑制。不同浓度的根皮苷给药组对细胞无抑制作用，OD值跟正常组比较，也无统计学意义，细胞的存活率大于90%，可以认为根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范围内，对细胞生长抑制不大，对细胞无毒性。

4讨论

根皮苷是一种在苹果树、多穗柯及植物甜茶叶中普遍存在的天然产物和膳食成分[6-8]，它具有降低血糖、抗氧化、抗癌等多种生物活性[9-11]。由于根皮苷广泛存在于药品、保健品中，并且根皮苷已经批准成为食品添加剂，可以作为甜食爱好者和糖尿病人的糖类替代食品[7],因此考察根皮苷对肝细胞毒性具有实际意义。

表1　根皮苷作用24 h对LO2细胞生长的影响

表2　根皮苷作用48 h对LO2细胞生长的影响

表3　根皮苷作用72 h对LO2细胞生长的影响

体外细胞毒性实验[13-14]是化学成分毒性研究的最常用方法之一，具有快捷、简便、直观的优势。本实验根据MTT比色法[15]的原理，测定根皮苷不同浓度对LO2细胞生长情况的影响，观察到根皮苷作用不同时间(24、48、72 h)对LO2细胞增殖是否有抑制作用。本研究发现根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范围内。正常对照组的细胞在48、72 h的时间段内增长率相近,细胞在72 h内呈正常生长状态。根皮苷给药组在用药干预48 h后各组细胞增长率比给药72 h后大；给药干预72 h后各组细胞的OD值呈增长趋势，但增长率减小，提示细胞仍处于生长阶段，而药物在给药72 h后对细胞生长速度有所抑制，但无统计学意义。因此可以说根皮苷对肝细胞生长抑制不大，对肝细胞未显示明显毒性。

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