涤痰通瘀方干预急性脑出血大鼠肝组织IRAK-M表达变化的影响

涤痰通瘀方干预急性脑出血大鼠肝组织IRAK-M表达变化的影响

王威1，许晓英1，马迪1，赵海滨1*，唐杰2，张秀静1，王帅1，翟瑶瑶1，张淑静3

(1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京房山区中医医院，北京 102400；

3.北京中医药大学，北京 100029)

摘要：目的研究急性脑出血大鼠肝组织中IRAK-M表达的变化,并探讨涤痰通瘀方剂对急性脑出血大鼠肝损害的干预作用。方法通过建立SD大鼠急性脑出血模型，并随机分为中药组(酒大黄、胆南星、石菖蒲、蒲黄、三七、水蛭)、脑出血组、假手术组、正常组，每组分为24、48、72 h 3个时间亚组,检测每组肝脏组织IRAK-M蛋白表达水平及肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并观察肝组织HE染色结果。结果脑出血模型组在造模后各个时间点IRAK-M蛋白表达水平较假手术组及正常组均明显降低(P<0.05)；中药治疗组的IRAK-M蛋白表达水平较脑出血模型组明显升高(P<0.05)，与假手术组、正常组相比略有降低；中药治疗组及脑出血模型组肝脏IRAK-M蛋白表达水平与组织TNF-α水平呈负相关。结论IRAK-M蛋白表达水平升高可能是抑制脑出血后诱发的LPS胞内信号转导炎性级联反应的重要因素；涤痰通瘀方剂可加强IRAK-M激酶活性，从而抑制炎症因子的释放,减轻急性脑出血大鼠肝脏损伤的程度。

关键词：白细胞介素-1受体相关激酶-M;急性脑出血;肝损害;涤痰通瘀法;肿瘤坏死因子-α

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.023

中图分类号：R285.5文献标志码： A

基金项目:国家自然科学基金(81373590)。

作者简介:王威(1983-)，女，硕士研究生，主要从事中西医结合防治心脑血管疾病研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-12-16)

*通信作者:赵海滨,电话-(010)52075211,电子信箱-haibin999@126.com

IRAK-M in liver during acute cerebral hemorrhage and effects of Ditantongyu measure

WANG Wei1,XU Xiaoying1,MA Di1,ZHAO Haibin1*,TANG Jie2,ZHANG Xiujing1,

WANG Shuai1,ZHAI Yaoyao1,ZHANG Shujing3

(1.The 3rd Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;

2.Fangshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102400,China;

3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the change of expression of IRAK-M in liver during Acute Cerebral Hemorrhage,and discuss the protection mechanism of Ditantongyu Measure.MethodsThe model of acute cerebral hemorrhage was established.The animals were randomly divided into three groups: TCM treatment group (the rhubarb,bravery south star,stone calamus,cattail pollen,notoginseng,leech),cerebral hemorrhage group,sham surgery group,blank control group.And each group was further divided into 3 time-point sub-groups of 24,48 and 72 h.The expression level of hepatic IRAK-M protein was measured,the hepatic content of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were detected,and HE staining results of liver tissue are observed.ResultsCompared with Group S and Group B,the expression levels of IRAK-M protein at each time-point post-modeling in both Groups T had markedly reduced (P<0.05).Groups T elevated markedly compared with Group C (P<0.05),but it decreased in Group S and Group B.The expression level of hepatic IRAK-M protein in Group T and Group C was negatively correlated with the changes of hepatic content of TNF-α.ConclusionIncrease of IRAK-M protein expression may be an important factor in the inhibition of after cerebral hemorrhage induced intracellular signal transduction of the inflammatory cascade reaction;Ditantongyu Measure can enhance the activity of IRAK-M,and it can restrain release of inflammatory factor,thus alleviating liver injury of rats with acute cerebral hemorrhage.

Keywords:Inter-leukin-1 Receptor Associated Kinase-M (IRAK-M);acute cerebral hemorrhage;liver injury;Ditantongyu measure;tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)

急性脑出血是一种常见的脑血管疾病，极易致残，甚至导致全身炎症反应综合征(SIRS)，或多器官功能障碍综合征(MODS)，更严重者可出现死亡。急性脑出血后，下丘脑功能紊乱，使内毒素生成增加，同时肠黏膜屏障受损，继而发生细菌易位，形成肠源性内毒素血症，最终导致肝损害[1]。内毒素又名脂多糖(LPS),可激活单核-巨噬细胞系统(MPS)，引起肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症介质大量释放，从而导致肝损伤[2]。近年来一些研究表明,白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)可以通过阻止特定的免疫复合物的形成或分离而中断信号转导，从而对由脂多糖诱导的一系列炎性级联反应产生负性调节作用。但其在脑出血肝损害中的变化及影响尚缺乏相关实验研究。本研究在既往急性脑出血肝损害模型研究的基础上,研究急性脑出血大鼠肝组织中IRAK-M表达的变化，并探讨涤痰通瘀方对其干预的影响。

1材料与方法

1.1动物与试剂选取健康成年雄性SD大鼠60只，体质量(250±50)g，由北京维通利华实验动物公司提供；涤痰通瘀方剂(酒大黄6 g，胆南星10 g，石菖蒲10 g，蒲黄15 g，三七10 g，水蛭10 g)由北京康仁堂中药有限公司提供。兔抗大鼠IRAK-M多克隆抗体(abcam公司，美国，货号ab8116)，二抗山羊抗兔IgG(H+L)，HRP(天德悦，货号S004)；Rat TNF-α ELISA kit(欣博盛公司，货号：ERC102a.96)。

1.2分组及模型制备将SD大鼠随机分为中药治疗组、脑出血模型组、假手术组、正常组4组，按照动物观察时间点平均分为造模后24、48、72 h各3个亚组,每组5只。实验动物适应性饲养3 d，实验造模前12 h禁食，自由饮水。参照相关文献[3]采用胶原酶注射法复制脑出血模型，并根据实验需要做一定改进。该法通过立体定向手术可造成各种部位的脑出血，且可通过控制Ⅶ型胶原酶量做分级实验性脑出血研究。鉴于临床脑出血以基底节多发，且肝损害多继发于严重脑出血。经过预实验分析和前期国家自然基金研究证实[4],本研究采用Ⅶ型胶原酶0.6 U注入大鼠基底节尾状核复制模型：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，俯卧固定于动物头颅立体定位仪上。根据大鼠大脑立体定位图谱，调整立体定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4 mm，此时前囟和后囟基本上在同一平面上；将头部背侧的鼠毛剪去，皮肤消毒后头皮十字切开，暴露颅骨，取前囟为原点，向右3 mm，向后0.1 mm处用牙科钻钻一个直径约1 mm的圆孔，采用微量注射器沿钻孔方向垂直进针，深约5 mm(为尾状核位置)，进针后缓慢注射Ⅶ型胶原酶0.6 U，留针5 min，缓慢退针，骨蜡封闭颅骨钻孔，消毒，缝合皮肤。假手术组于大鼠基底节尾状核处注入等量的生理盐水。中药治疗组和西药治疗组于脑出血造模手术前2 d开始灌胃给药，1次/d，手术前2 h加灌1次，手术后每天灌胃1次，各时相点处死前2 h加灌1次；脑出血模型组和假手术组给予相同剂量蒸馏水，大鼠给药量按《药理实验方法学》[5]所示剂量换算法计算：大鼠用药剂量(g/kg)=6.25×成人用药剂量(g/kg)。

1.3检测指标1)各组肝脏组织IRAK-M蛋白表达水平：采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测，提取肝组织总蛋白，并进行定量检测后，经过制胶、上样及电泳，选用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在100 V电压下转膜，并用脱脂奶粉封闭后，分别加入兔抗大鼠IRAK-M多克隆抗体及HRP标记的羊抗兔IgG孵育，最后加入ECL发光夜在暗室中室温下曝光显色，用Bio-rad凝胶成像系统对目的条带进行密度分析。2)各组肝脏组织TNF-α含量：提取肝组织总蛋白，并进行定量检测后，按照ELISA试剂盒说明方法检测TNF-α含量。3)各组肝组织病理检测：冰上打开腹腔，分别进行腹主动脉取血处死，分离取材肝右后叶组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚6 μm，58 ℃烘烤48 h，HE染色，在光镜下进行病理观察。

2结果

2.1各组肝脏IRAK-M蛋白表达水平的变化比较假手术组在肝脏中IRAK-M的表达处于较高水平，并且不随时间变化，与正常组比较各时间点均无显著差异；脑出血模型组与正常组比较IRAK-M表达明显降低，但在72 h时间点差异无统计学意义;中药治疗组中IRAK-M的表达较脑出血模型组升高，24 h时开始升高(P<0.05)，48 h时显著升高(P<0.01)，72 h时略有降低(见表1)。

组 别24h48h72h中药组 0.85750±0.05123△ 0.74500±0.04435△△0.85760±0.05916△模型组 0.73500±0.04203##0.59000±0.03651##0.75500±0.06758 假手术组1.05250±0.07136△△0.99000±0.08832△△0.92250±0.04031 正常组 1.10250±0.09979 0.88750±0.03500 0.71470±0.08616

注：与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2各组肝脏TNF-α含量的变化比较与正常组相比，脑出血模型组各时间点TNF-α水平均显著升高(P<0.01)。中药治疗组各时间点TNF-α水平均较正常组略有降低，但差异无统计学意义，假手术组在72 h显著升高(P<0.01),其余时间点差异无统计学意义；中药组与脑出血模型组比较在24 h时TNF-α水平有所降低(P<0.05)，48 h，72 h时均显著降低(P<0.01)，假手术组各时间点TNF-α水平较模型组比较均降低，但24 h时差异无统计学意义，48 h及72 h组均显著降低(见表2)。

表2　各组肝脏TNF-α含量的变化

注：与脑出血组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.3肝组织病理学观察HE染色显示，正常组肝小叶结构清晰可辨，组织结构完整正常，无肝细胞变性坏死，肝细胞索排列整齐，肝窦及中央静脉无异常，中央静脉管壁由一层内皮细胞围成，向四周呈放射状排列成肝板。肝细胞多边形，椭圆球形，位于细胞中央，被染成蓝色，胞质被染成紫红色，细胞界限清晰。肝血窦位于肝板之间，结构清晰完整。

脑出血模型组肝脏组织切片，肝小叶结构大部分清晰可辨，大部分肝细胞索排列整齐，肝窦及中央静脉无异常，中央静脉管壁由一层内皮细胞围成，管壁上有一些肝血窦开口，肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列成肝板，有炎症细胞浸润现象及出血现象。

假手术组肝脏组织切片可见，肝组织结构完整正常，肝细胞索排列整齐，肝窦及中央静脉无异常，中央静脉管壁由一层内皮细胞围成，向四周呈放射状排列成肝板。肝细胞多边形，椭圆球形，位于细胞中央，细胞界限清晰。肝小叶结构清晰，偶有炎细胞浸润。

中药组肝脏组织切片，肝组织出现少量肝细胞肿大现象，细胞形态不清晰，有少量炎症细胞浸润，且伴有少量出血现象。肝小叶结构仍清晰可辨，大部分肝细胞索排列整齐，肝窦及中央静脉无异常，中央静脉管壁由一层内皮细胞围成，管壁上有一些肝血窦开口，肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列成肝板。

3讨论

近年来，研究认为肝损伤与MODS同源，是由内毒素、炎症性因子、氧自由基、细胞凋亡等多因素参与、多种炎症介质共同作用的复杂的病理生理过程。对于急性脑出血后，下丘脑功能紊乱，使内毒素生成增加，进而发生内毒素易位诱发LPS胞内信号转导炎性级联反应,释放大量炎性因子导致肝损伤。因此了解复杂的炎症反应调控机制对研究出新的治疗方法具有重要作用。

迄今为止，经研究发现IRAK家族成员主要包括：IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M和IRAK-4，其中IRAK-1和IRAK-4有激酶活性，可激活信号通路；IRAK-2与IRAK-M无激酶活性，起负性调节作用[6]。而目前发现 IRAK-M 在肝内胆管上皮细胞胞质和肝实质细胞胞核、肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞、血液中单核/巨噬细胞、破骨细胞等均可表达[7-9]。肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)、CpG-DNA及NO供体GSNO等刺激可使IRAK-M的表达上调[10]。

急性脑出血后下丘脑功能紊乱，使LPS的生成增加，内毒素过量易位，LPS信号首先经肝KC的Toll样受体4(TLR4)胞内段与髓性分化蛋白88(MyD88)C末端的TLR结构域相作用，进而IRAK-1、IRAK-4均结合到受体复合物，并导致IRAK-1磷酸化(活化)。活化后的IRAK-1与受体复合物的亲和力下降而分离，并与肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6)形成复合物,引起TRAF6发生低聚作用，最终激活核转录因子NF-κB，导致TNF-α等一系列炎症细胞因子基因的转录和表达。而IRAK-M作为负性调节因子，通过抑制IRAK-4诱发的IRAK-1的磷酸化，稳定TLR/My88/IRAK-4/IRAK-1复合物，阻止下游IRAK-TRAF6复合体形成，导致TLRs信号中断[6]。

本研究通过建立大鼠脑出血模型表明，脑出血模型组的IRAK-M蛋白表达较中药治疗组明显降低，并较假手术组及正常组显著降低;而脑出血组肝脏中TNF-α水平较中药组和正常组均显著升高,与IRAK-M蛋白表达水平变化相反。而且病理观察结果显示，中药组病变要较脑出血组轻,假手术组次之。该结果说明，在脑出血大鼠中由于内毒素生成过量易位使IRAK-M的表达下调，从而使LPS通过TLR/IL-1R介导的炎症信号通路开放，促使TNF-α等炎症因子释放，导致肝脏损害。

在肝脏中,TNF-α主要由肝枯否细胞产生，是肝发生炎性反应时主要的致病因子。且已有研究表明，TNF-α能直接损害肝细胞，进而引起肝损伤[11]。DENG J C等[12]发现，在IRAK-M基因缺乏小鼠中组织炎症反应较正常小鼠显著增强，同时检测到TNF-α等炎症因子的表达也明显增强。本研究结果也提示了机体IRAK-M表达的缺乏可导致TNF-α表达的增强，从而增强相应组织的炎症发应,由此更进一步说明了IRAK-M的负性调节作用。

脑出血属于中医“出血性中风”范畴，其急性期以痰瘀腑实证候较为多见。中风的发生主要基于气血亏虚，在各种诱因的刺激下出现心、肝、肾三脏阴阳失调，气血逆乱，挟痰挟瘀，横窜经髓，而形成上实下虚，阴阳互不维系的危机证候。其病因主要包括风、火、痰、气、血等，由于机体气血阴阳失调，致津液不化，痰邪迅速滋生，兼之瘀血内阻，血瘀则痰滞，痰瘀相兼为患[13]。故而本研究以涤痰通瘀方立法，选用由酒大黄、胆南星、石菖蒲、蒲黄、三七、水蛭组成的涤痰通瘀方剂进行干预治疗。实验结果显示中药治疗组IRAK-M的表达较脑出血模型组明显升高，而TNF-α水平较脑出血模型组却显著降低，说明涤痰通瘀方剂可以通过增强IRAK-M的表达,从而抑制肝组织内部分炎症因子的释放而发挥保护肝脏的作用。而对于涤痰通瘀方剂对其的具体作用靶点仍有待进一步研究。

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