蟒蛇活性寡肽的分离及其抗氧化活性研究

蟒蛇活性寡肽的分离及其抗氧化活性研究

高颖，高晓晨，姜威，鲍悦，张辉*，孙佳明*

(长春中医药大学,长春 130117)

摘要：目的对蟒蛇活性寡肽分离及纯化，并对单体寡肽进行抗氧化活性研究。方法以蟒蛇活性肽为原料，采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱法，反相硅胶C8柱色谱法，ODS-C18高效液相制备柱色谱法进行分离纯化，得到蟒蛇单体寡肽，以羟基自由基清除率作为评价指标，对蟒蛇单体寡肽进行抗氧化性能考察。结果得到蟒蛇单体寡肽MS-A和MS-B，测得MS-A的清除羟基自由基的IC50值为6.52 mg/mL，MS-B的清除羟基自由基的IC50值为8.39 mg/mL，同法测得Vc的IC50值为0.35 mg/mL。结论蟒蛇单体寡肽具有良好的抗氧化活性。

关键词：蟒蛇活性肽；分离；抗氧化

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.020

中图分类号：R282文献标志码： A

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字[2012]第77号)。

作者简介：高颖(1974-)，女，硕士研究生导师，主要从事中药与天然药物化学研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2015-10-10)

*通信作者：张辉,电话-(0431)86172080,电子信箱- zhanghui-8080@163.com;

孙佳明,电话-(0431)86172280, 电子信箱-sun_jiaming2000@163.com

Separation and antioxidant activity of oligopeptides from python

GAO Ying, GAO Xiaochen, JIANG Wei, BAO Yue, ZHANG Hui*, SUN Jiaming*

(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract：ObjectiveTo separate and purify the python active oligopeptide, and to research the antioxidant activity of single peptide. MethodsWith the python active peptide as raw material, Sephadex LH-20 chromatography, reversed phase C8 column chromatography, ODS-C18 HPLC column chromatography were used to separate and purify, obtain the python oligopeptide, the hydroxyl radical scavenging rate as the evaluation index, investigate the python oligopeptide of the antioxidant properties. ResultsObtained the python oligopeptide MS-A and MS-B, MS-A of scavenging hydroxyl free radical of the IC50 values was measured is 6.52mg/ml, the IC50 values of MS-B is 8.39mg/ml. With the IC50 values of Vc is 0.35 mg/mL. ConclusionPython peptide has good antioxidant activity.

Keywords：python active peptide; separation; antioxidation

蟒蛇是当今世界上最原始的优质蛇种之一，具有一般蛇类不可比拟的经济价值、营养价值和药用价值。蟒蛇入药最早记载于南北朝《名医别录》，在《本草纲目》中也被收载于蛇胆项下，其中记载蚺蛇胆，味甘、苦、寒，有小毒。主心痛，下腹疮，目肿痛。蟒蛇肉具有祛风活络，杀虫止痒的功效，多被用于风痹瘫痪，疥癣恶疮等证的治疗。同时也是一种营养价值很高的食物，具有舒筋活络、滋补身体之功效[1-4]。近年来，未见对蟒蛇活性寡肽的分离及其抗氧化活性的相关报道，这无疑阻碍了蟒蛇资源的进一步开发和利用。因此，为了更好的应用蟒蛇动物药资源，有必要对蟒蛇活性寡肽进行深入研究[5]。

1材料与仪器

蟒蛇蛇肉蛋白质酶解生物活性肽由长春中医药大学中医药与生物工程研发中心自制。甲醇等试剂均为分析纯。DBS-160电脑全自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司)，Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，反相硅胶中压柱(Sciences-AB)，高效液相色谱仪(Agilent 1100)，十万分之一电子天平(BP211D)(德国赛多利斯天平有限公司)，电热恒温水浴锅(江苏南通县通海电器厂)。

2方法与结果

2.1蟒蛇活性肽的分离、纯化

2.1.1 Sephadex LH-20凝胶柱色谱法分离活性肽取蟒蛇酶解肽冻干粉50 mg，加水溶解，过0.45 μm水膜，将滤液上Sephadex LH-20凝胶柱，用蒸馏水洗脱，得到100个流分。根据紫外检测器在220 nm处的吸光值制定蟒蛇酶解肽的洗脱分布图，见图1。

图1　蟒蛇酶解肽的Sephadex LH-20色谱图

从图上可以看出流分Fr.13～Fr.22和Fr.34～Fr.52的为主要色谱峰，合并，冻干，分别命名为MS-01和MS-02。

2.1.2反相硅胶C8柱色谱法纯化MS-01和MS-02将从凝胶柱分离下来命名为MS-01和MS-02的冻干粉，用10%的甲醇-水系统溶解过膜，分别上C8反相柱，洗脱，自动流分收集器收集，波长220 nm，流速3，自动接样流分5 mL/管。

MS-01经分离收集流分Fr5～12，经薄层色谱检视，具有相同颜色和Rf值斑点的流分合并，命名为MS-01-A。

MS-02经分离收集流分Fr16～24，经薄层色谱检视，具有相同颜色和Rf值斑点的流分合并，命名为MS-02-A。

2.1.3ODS-C18高效液相制备柱色谱法制备单体寡肽将ODS-C8中压制备柱层析洗脱流分MS-01-A和MS-02-A进行ODS-C18高效液相制备柱层析。采用制备柱Venusil ASB C18(5 μm 150Å 10 mm×150 mm)，15%MeOH(1‰甲酸)等度洗脱，检测波长220 nm，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃。结果见图2、图3。经过高效液相色谱反复制备，最后得到单体化合物MS-A和MS-B。MS-A和MS-B经上述色谱条件，更换分析柱Venusil ASB C18(5 μm 150Å 4.6 mm×250 mm)进行纯度检测，面积归一化法显示二者纯度分别为97%和95%。

2.2单体寡肽MS-A、MS-B羟基自由基清除活性的测定

2.2.1羟基自由基清除活性的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[6]。取0.80 mmol/L邻二氮菲1 mL于试管中依次加入2 mLPBS(0.2 mol/L,pH7.37)和1mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁(FeSO4·7 H2O)1 mL，混匀后，加入0.01%双氧水(H2O2)1 mL，于37 ℃水浴60 min，在510 nm测其吸光度值，所测得的数据为损伤管的吸光度值A(损)。未损伤管以1 mL蒸馏水代替损伤管中的1 mL0.01%的双氧水(H2O2)，操作方法同损伤管，可测得510 nm未损伤管的吸光度值A(未)。样品管以已经补足至1 mL的样品代替损伤管中的1 mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得510 nm样品管的吸光度值A(样)。各样品管中加入的溶剂如下：

A(损)：邻(1 mL)+PBS(2 mL)+H2O(1mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O2(1 mL)

A(未)：邻(1 mL)+PBS(2 mL)+H2O(1mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O(1 mL)

A(样)：邻(1 mL)+PBS(2 mL)+样品(1 mL)+ FeSO4·7 H2O(1 mL)+ H2O2(1 mL)

根据如下公式进行数据处理：

羟基自由基清除率D(%)=[A(样)-A(损)] /[A(未)-A(损)]×100%

2.2.2结果分析测定蟒蛇酶解肽单体MS-A、MS-B的羟基自由基清除率，结果见图3、图4。

经测定得到蟒蛇活性寡肽MS-A的清除羟基自由基的IC50值为6.52 mg/mL，MS-B的清除羟基自由基的IC50值为8.39 mg/mL，同法测得Vc的IC50值为0.35 mg/mL。结果显示，蟒蛇酶解肽化合物对·OH均有一定的清除能力，且与Vc对比,化合物MS-A、MS-B的抗氧化活性弱于Vc。

3结论

结果表明，蟒蛇单体寡肽MS-A、MS-B均具有较好的抗氧化活性。本文首次采用凝胶柱层析、反相硅胶C8柱层析及ODS-C18制备柱层析相结合的方法分离提取蟒蛇酶解肽，得到具有抗氧化功能的单体寡肽，为以蟒蛇酶解肽为原料的具有抗氧化功能保健食品的深入开发奠定基础，进而可带动蟒蛇养殖和深加工等产业化规模，创造更大的经济效益和社会效益。

图2　MS-01-A高效液相色谱图

图3　MS-02-A高效液相色谱图

图4　蟒蛇酶解肽单体MS-A对羟自由基的清除能力

图5　蟒蛇酶解肽单体MS-B对羟自由基的清除能力

参考文献：

[1] CHEN H M,MURAMOTO K,YAMAUCHI F,et al.Antioxida-tive properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998(46):49-53.

[2] CHEN J,SUETSUNA K,YAMAUCHI F.Isolation and characterization of immunostimulative peptides from soybean[J].Journal of Nutrition Biochemistry,1995(6):310-313.

[3] 宾冬梅,钟福生.蛇肉的营养与粗加工[J].蛇志,2003(1):65-68.

[4] 高颖,孙佳明,张辉. 蟒蛇活性肽抗氧化作用的研究[J].吉林中医药,2012,32(11):1138-1139.

[5] 邵江娟,姚忠,吴昊,等.牡蛎抗氧化寡肽的提取分离研究[J].中药材,2013,36(9):1395-1397.

[6] 杜丹,王晨,艾凤伟,等.微波提取八角茴香挥发油的工艺及抗氧化活性研究[J].吉林中医药, 2011,31(5):466-468.