HLA-B 特异性抗原Bw4与新疆汉族鼻咽癌的相关性研究

HLA-B特异性抗原Bw4与新疆汉族鼻咽癌的相关性研究

黄莉, 王若峥

(新疆医科大学附属肿瘤医院头颈放疗科， 乌鲁木齐830011)

摘要:目的探讨HLA-B特异性抗原Bw4与新疆汉族鼻咽癌发病的关系。方法应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术，对131例汉族鼻咽癌患者(鼻咽癌组)和168例汉族健康体检者(对照组)进行HLA-B位点等位基因分型，确定Bw4、Bw6抗原的特异性分布，分析HLA-B携带Bw4对鼻咽癌患者CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的影响。结果(1)鼻咽癌组Bw4抗原携带者66例(50.4%)，健康对照组Bw4抗原携带者120例(71.4%)，鼻咽癌组Bw4抗原表达频率明显低于健康对照组，两组比较差异有统计学意义(χ2=13.869，P=0.000)。(2)鼻咽癌组CD4+T淋巴细胞水平低于健康对照组，CD8+T淋巴细胞水平高于健康对照组，两组比较差异均有统计学意义(t=2.765，P=0.009；t=-1.768，P=0.043)。(3)鼻咽癌患者中Bw4阳性组CD4+T淋巴细胞水平高于Bw4阴性组，两组比较差异有统计学意义(t=3.002，P=0.005)，两组CD8+T淋巴细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Bw4抗原的缺失可能与新疆汉族鼻咽癌的发生有关，HLA-B特异性抗原Bw4对汉族鼻咽癌患者有一定的保护作用。

关键词:鼻咽癌； HLA-B； Bw4； T淋巴细胞亚群

中图分类号：R739.6文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.009

[收稿日期：2015-01-05]

基金项目：中国科学院上海巴斯德研究所/新疆医科大学第一附属医院感染与免疫联合开放实验室种子基金(GRMY-2011-02)

作者简介：聂晶(1983-)，女，本科，技师，研究方向：皮肤激光美容。

The association between HLA-B antigen carrying Bw4 epitope and

nasopharyngeal carcinoma among Han people in Xinjiang

HUANG Li, WANG Ruozheng

(DepartmentofHeadandNeckRadiation,theAffiliatedTumorHospitalof

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjcetiveTo investigate the relationship between human leukocyte antigen-B(HLA-B) antigen carrying Bw4 and Han people with nasopharyngeal carcinoma (NPC) in Xinjiang. MethodsPolymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) technique was employed to detect the allele frequency of HLA-B in 131 Han NPC patients and 168 normal controls. HLA-Bw genotypes were determined and their association with CD4+ T cell, CD8+T cell were analyzed. Results(1) There were 66(50.4%) cases with Bw4 in NPC, and 120(71.4%) cases with Bw4 in normal controls. The population frequency of Bw4 in NPC was lower than normal controls (χ2=13.869， P=0.000). (2)The percentage of CD4+ T cell in Han NPC was lower than normal controls (t=2.765， P=0.009) and the percentage of CD8+ T cell in Han NPC was higher than normal controls (t=-1.768， P=0.043). (3)In NPC, the group with Bw4 had higher percentage of CD4+ T cell compared with the group without Bw4 (t=3.002， P=0.005) and there was no significant differences in the percentage of CD8+ T cell between the two groups (P>0.05). ConclusionBw4 deficiency was associated with Han NPC in Xinjiang. HLA-B antigen carrying Bw4 has protective effect in Han NPC.

Key words: nasopharyngeal carcinoma; human leukocyte antigen-B (HLA-B); Bw4; T cell

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种常见的恶性肿瘤，我国是世界上发病率最高的国家之一，但南北方发病率的差异非常大，地区分布极不均衡，鼻咽癌的发病率由北到南逐渐升高，东南沿海地区尤为高发。大量的研究表明，人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA )多态性与鼻咽癌高度相关[1-3]。HLA是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，而HLA-B是最具多态性的HLA-I类基因，根据B位点第二外显子C末端77~83位所编码氨基酸序列的差异可以分为Bw4或Bw6抗原2种血清型[4]。有研究发现HLA-Bw4可能增强特异性T细胞免疫，对机体有一定的保护作用[4-5]。目前对HLA-Bw4的研究主要集中于艾滋病方面，而与鼻咽癌相关的研究甚少。本研究通过观察Bw4抗原在鼻咽癌患者中的分布情况，检测外周血液CD4+、CD8+T细胞水平，探索Bw4抗原在鼻咽癌发生、发展中的作用，现报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象选择2012年1月-2014年7月新疆医科大学附属肿瘤医院头颈放疗科收治的病理确诊的汉族鼻咽癌患者131例(鼻咽癌组)，其中男性95例，女性36例，年龄11～81岁，中位年龄45岁。所有患者入院行外周血EBV VCA-IgG检测均为阳性。根据2002年国际抗癌联盟(UICC) /美国癌症联合会(AJCC ) 分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期11例，Ⅲ期53例，Ⅳ期66例；病理类型(根据WHO分型标准)：Ⅰ型(角化性癌)1例，Ⅱ型(非角化性癌)58例，Ⅲ型(未分化癌)72例。同时选择新疆医科大学健康自愿献血的汉族学生或职工为健康对照组，无鼻咽癌家族史。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，所有入组人员均签署知情谈话同意书。

1.2研究方法

1.2.1全血基因组 DNA 的提取采集外周静脉血5 mL(EDTA抗凝)，采用北京天根生物技术有限公司的的全血基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作进行DNA提取。应用紫外分光光度仪(Thermo Spectrophotometer-1510) 测定DNA浓度及260 nm与280 nm波长处的吸光度(A)值，A260/A280比值均为1.7～1.9，调整终浓度为0.3~0.5 μg/μL， 置于-20℃冰箱保存。

1.2.2HLA-B位点等位基因分型采用聚合酶链反应/序列特异性引物( polymerase chain reaction sequence specific primers，PCR-SSP) 的方法进行HLA-B位点等位基因分型。HLA分型至少采用两位数的分辨率，由英国牛津大学HLA分型实验室完成。

1.2.3CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群检测采用美国Becton Dickinson公司的FACS calibur流式细胞仪，利用美国Becton Dickinson公司配套的淋巴细胞亚群检测试剂盒(CD4/CD8/CD3 三色荧光单克隆抗体)检测。采用BD公司的SimulSET自动分析软件进行淋巴细胞亚群测定和分析，计算CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群所占的百分率。

2结果

2.1HLA-B位点等位基因分型及Bw4、Bw6特异性抗原分类131例鼻咽癌患者中共检测到25种HLA-B等位基因，168例健康对照者中共检测到23种HLA-B等位基因。根据IMGT/HLA数据库提供的Bw4、Bw6对照表和HLA汇总表信息[6]，本研究对象共有Bw4/4纯合子、Bw4/6杂合子和Bw6/6纯合子3种基因型，其中鼻咽癌组Bw4/4纯合子20例(15.2%)，Bw4/6杂合子46例(35.1%)，Bw6/6纯合子65例(50.4%)；健康对照组Bw4/4纯合子36例(21.4%)，Bw4/6杂合子84例(50.0%)，Bw6/6纯合子48例(28.6%)。

2.2鼻咽癌组与健康对照组Bw4特异性抗原分布情况鼻咽癌组Bw4抗原携带者66例(50.4%)，健康对照组Bw4抗原携带者120例(71.4%)，两组比较差异有统计学意义(χ2=13.869，P=0.000，OR=0.406，95%CI：0.252~0.656)(表1)。鼻咽癌组Bw4基因频率为32.8%(86/262)，健康对照组Bw4基因频率为46.4%(156/336)，两组比较差异有统计学意义(χ2=11.309，P=0.001，OR=0.564，95%CI：0.403~0.788)。

表1　鼻咽癌组与健康对照组Bw4特异性抗原分布情况/例(%)

2.3两组中CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群测定情况研究对象中鼻咽癌初治患者32例、健康对照40例进行了外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平测定。鼻咽癌组外周血CD4+T淋巴细胞水平低于健康对照组，CD8+T淋巴细胞水平高于健康对照组，两组比较差异均有统计学意义(t=2.765，P=0.009；t=-1.768，P=0.043)(表2)。32例鼻咽癌患者中Bw4/4纯合子2例,Bw4/6杂合子15例,Bw6/6纯合子15例，因Bw4/4纯合子例数较少，故将32例患者分为Bw4阳性组(Bw4/4纯合子及Bw4/6杂合子)和Bw4阴性组(Bw6/6纯合子)。Bw4阳性组CD4+T淋巴细胞水平高于Bw4阴性组，两组比较差异有统计学意义(t=3.002，P=0.005)，两组CD8+T淋巴细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表2鼻咽癌组与健康对照组CD4+、CD8+T淋巴细胞水平比较(%，)

组别nCD4+T细胞CD8+T细胞鼻咽癌组3233.897±10.13624.541±9.377健康对照组4038.652±8.70222.637±7.561t值2.765-1.768P值0.0090.043

表3鼻咽癌不同分组中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平比较(%，)

组别nCD4+T细胞CD8+T细胞Bw4阳性组1734.269±5.45925.989±4.589Bw4阴性组1529.063±4.15822.427±6.268t值3.0021.844P值0.0050.075

3讨论

鼻咽癌是一种来源于鼻咽部上皮的恶性肿瘤，其发生具有显著的地域差异和家族聚集性特点。姚开泰和曾毅教授等提出了遗传因素、环境因素及EB病毒共同作用的三次打击学说来解释鼻咽癌的发生，认为一些病例可能发生了种系突变(一次打击)，随后EB病毒感染可能作为“二次打击”，在环境因素(三次打击)的协同作用下最终发展为鼻咽癌[7]。即使中国高发区居民移居海外数年后仍有较高的发病率，提示遗传因素对鼻咽癌的发生有重要影响[8]。

研究表明，机体抗肿瘤的效应主要以T细胞介导的细胞免疫为主，HLA与抗原多肽形成复合物，被T细胞识别，诱发特异性T细胞反应[9]。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer immunoglobulin-like receptors，KIR)是一种表达在NK细胞及部分T细胞表面的受体，通过与HLA-I类分子结合调节NK细胞和T细胞的活性，具有高度的多态性，分为抑制性受体和活化性受体，抑制性KIR与自身正常细胞表达的HLA-I类分子结合后导致NK细胞失活，从而发挥对正常细胞的保护作用，当细胞表面HLA-I类分子表达异常时，NK细胞活性不被抑制，对变异细胞进行攻击[10]。HLA-Bw4是抑制性受体KIR3DL1的配体，而HLA-Bw6不是KIR的配体[11]。Carrington等[12]研究发现，抑制性KIR-HLA对宫颈癌的发生有保护作用，随着NK细胞从抑制到活化，患宫颈癌的风险逐渐升高。Butsch等[13]通过病例对照研究发现，在 EBV 抗体阳性的个体中，有活化性 KIR 数目≥5的个体患鼻咽癌的风险是没有活化性KIR个体的3.4倍。本研究通过对131例汉族鼻咽癌患者及168例健康对照进行Bw4、Bw6抗原分类，结果显示鼻咽癌组Bw4抗原携带频率明显低于健康对照组，两者差异有统计学意义(P=0.001，OR=0.564，95%CI：0.403~0.788)，原因可能是因为Bw4抗原缺失，无法与抑制性受体KIR3DL1结合，降低了NK细胞对正常细胞的保护作用，在EB病毒及环境因素的协同作用下，活化的NK细胞介导持续的炎症反应导致细胞发生癌变，一定程度上Bw4 抗原缺失可能参与了鼻咽癌的发生。

Kim等[14]研究发现，在HIV感染过程中，感染结局较好的基因如HLA-B27、B51和B57等均是Bw4特异性的，而感染结局较差的基因如B8、B35等均是Bw6特异性的。Qing等[15]报道Bw4对HIV感染有一定的保护作用，而Bw6纯合子与加速疾病进程相关。López等[16]提出携带Bw4 抗原一定程度上可以阻止HCV感染者发展至肝癌。刘珣等[5]研究发现，Bw4/4纯合子HCV感染者病毒载量明显低于Bw4/6杂合子及Bw6/6纯合子，且特异性T细胞反应较强，提示Bw4抗原对HCV感染具有一定的保护作用。陈建平等[4]通过对340例HIV感染者进行CD4+T淋巴细胞检测，发现Bw4携带者(Bw4/4纯合子和Bw4/6杂合子)相对Bw6/6纯合子具有更高的CD4+T细胞计数和更低的病毒载量。T细胞亚群在肿瘤免疫中发挥重要作用，各亚群之间的数量和比例稳定，机体才能有效地防御和抑制肿瘤，活化的CD4+T淋巴细胞能直接杀死肿瘤细胞，并对CD8+T淋巴细胞及B细胞起重要的辅助作用，而CD8+T淋巴细胞属于抑制性T细胞，可对靶细胞产生细胞毒作用，抑制免疫反应。本研究对32例鼻咽癌患者及40例健康对照进行CD4+、CD8+T淋巴细胞检测，结果显示鼻咽癌组CD4+T细胞水平低于健康对照组(P<0.05)，而CD8+T细胞水平高于健康对照组(P<0.05)，提示与健康人群比较,鼻咽癌患者免疫功能受到抑制，与文献[17-18]报道一致。同时本研究显示鼻咽癌Bw4阳性组CD4+T淋巴细胞水平高于Bw4阴性组(P<0.05)，而两组CD8+T淋巴细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示Bw4阳性组免疫功能高于Bw4阴性组，Bw4抗原可能对鼻咽癌患者有一定的保护作用，与文献[4]研究结果相似，但有待继续扩大样本量并随访观察其疾病进展情况，以期Bw4能作为预测鼻咽癌疾病发展的指标之一。

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2.融资管理。企业的发展需要资金的支持，因此企业的融资是不可避免的。企业外部的融资必须要根据企业的实际发展情况以及资本结构来进行，同时需要对金融市场进行分析，制定出合理的融资方法，最终对于企业的生产经营产生促进作用。因此，企业的融资管理是企业经营过程当中的核心内容，直接关系着企业的资本运营以及经营方法，对于企业的长期发展有着非常重要的作用。

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(本文编辑周芳)

通信作者：朱雅琳，女，博士，副主任医师，研究方向：皮肤激光美容，E-mail: 294198014@qq.com。