异丙肾上腺素对婴儿血管瘤内皮细胞影响的体外研究

异丙肾上腺素对婴儿血管瘤内皮细胞影响的体外研究

聂晶1， 帕提古丽·买买托合提2， 朱雅琳1

(1新疆医科大学第一附属医院皮肤科， 乌鲁木齐830054；2新疆和田地区墨玉县人民医院皮肤科， 新疆和田848000)

摘要：目的探讨不同浓度异丙肾上腺素在体外对婴儿血管瘤内皮细胞生长的影响及β-肾上腺素受体在婴儿血管瘤发病机制中的作用。方法将增殖期婴儿血管瘤内皮细胞分为空白组(不含药物培养基)及异丙肾上腺素低浓度组(5、10、20 mg/L)与高浓度组(50、100、200 mg/L)。药物作用1~10 d采用MTT法分别测定各组细胞的生长曲线。结果低浓度组24~96 h对细胞生长呈现刺激作用；96 h时,低浓度组与空白对照组的吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)。而高浓度组在24~96 h对细胞生长呈现抑制作用，与空白对照相比，高浓度组细胞的吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)，并且24~96 h浓度越高，作用越强。结论β-肾上腺素受体在婴儿血管瘤发病中有重要作用;异丙肾上腺素对于体外培养的增殖期血管瘤内皮细胞的刺激作用与浓度相关。

关键词:婴儿血管瘤; 血管内皮细胞; 异丙肾上腺素; β-肾上腺素受体

中图分类号：R969.4文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.010

[收稿日期：2015-02-07]

基金项目：新疆地方病分子生物学实验室开放课题基金(XJDX0208-2011-06)

作者简介：祖力卡尔江·阿合买提，男(维吾尔族)，硕士，研究方向：龋病学的防治研究。

The effect of isoproterenol on hemangioma endothelial cells in vitro

NIE Jing1, Patiguli Maimaituoheti2，ZHU Yalin1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830054,China;2DepartmentofDermatology,XinjiangHetian,People′sHospital,

Hetian848000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the different concentrations of isoproterenol in vitro effects on infant hemangioma endothelial cell growth and to study the function of beta adrenergic receptors in the pathogenesis of infantile hemangioma. MethodsInfantile hemangioma endothelial cells in proliferating phase were divided into three groups, the blank group (without drug culture medium), low concentration group(5, 10, 20 mg/L) of isoproterenol and high concentration group (50, 100, 200 mg/L). The growth curve of cells in each group were measured after a certain time by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) method. ResultsLow concentration group showed stimulation affection on cell growth within 24-96 hours; and in the high concentration group, cell growth were inhibited within 24-96 hours, and the hiher concentration, the stronger the effect within 24-96 hours. ConclusionBeta adrenergic receptors play an important role in the pathogenesis of infantile hemangioma;stimulation effection of isoproterenol is related with concentration of drug for in vitro culture of hemangioma endothelial cells.

Key words： infant hemangioma; endothelial; isoproterenol; beta adrenergic

血管瘤是由胚胎期血管网增生所形成。在胚胎早期，原始血管是一种单纯由内皮细胞组成的管状物，它们在间质中形成一个致密的网。随着各器官和组织的发育，原始血管网逐渐分化成为与它们之间联系的许多血管丛。根据原始血管内的流量和压力，形成供应血管(动脉)或引流血管(静脉)。体表和皮下组织的血管网易发生不规则的局部增生，日后即成为血管瘤。血管瘤是一种先天性发育异常，属于错构瘤性质，而非真性肿瘤，具有畸形和肿瘤的双重特性。婴儿血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤，大多位于头颈部，位置较表浅，也有少数发生在黏膜、肌肉、骨骼组织和内脏，不仅影响美观，而且影响功能，甚至危及生命。目前血管瘤的发病机制尚不清楚。异丙肾上腺素属于β-受体拮抗剂，与心得安的作用相拮抗，2008年有研究报道普萘洛尔(心得安)对血管瘤有明显疗效[1]。因此β-肾上腺素受体在血管瘤发病中的作用也越来越受到人们的关注。本研究使用不同浓度的异丙肾上腺素作用于体外培养的血管瘤内皮细胞，探讨不同浓度异丙肾上腺素在体外对婴儿血管瘤内皮细胞生长的影响及β-肾上腺素受体在婴儿血管瘤发病机制中的作用。

1材料与方法

1.1材料血管瘤标本来自临床手术切除的颞部增殖期血管瘤，患儿女性，9个月。试剂： EGM-2培养基(瑞士LONZA公司)，0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)，PBS(美国HyClone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原一抗(武汉博士德生物公司)，兔抗人VEGFR-2一抗(武汉博士德生物公司)，HRP多聚抗兔IgG(武汉博士德生物公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德生物公司)。主要设备：倒置显微镜，酶标仪，离心机，CO2培养箱。

1.2方法

1.2.1血管瘤内皮细胞原代培养手术切除血管瘤标本立即放入1640无血清培养基储存，并迅速移至实验室超净台。血管瘤标本去上清，将标本移至无菌培养皿后，使用含双抗PBS冲洗2遍。冲洗后更换培养皿,继续PBS冲洗3遍。在培养皿内进行标本修剪，去除表皮、结缔组织，并剪成1 mm×1 mm左右的碎块，继续PBS冲洗2遍。0.25%胰蛋白酶(HyClone)37℃震荡消化3~4 h，使用含20%胎牛血清1640培养基终止消化，过滤，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，20%胎牛血清1640培养基再次重悬并离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，加入EGM-2(LONZA)培养基(含有血管内皮细胞生长因子、氢化考的松、抗坏血酸、人碱性成纤维细胞生长因子B、人胰岛素样生长因子、表皮生长因子)并移入25 cm2培养瓶，放入37℃ CO2培养箱。24 h后观察细胞贴壁，换液。随后每2~3天换液，细胞铺满瓶底70%~80%传代，所有操作均在超净台完成，全程始终无菌操作。

1.2.2血管瘤内皮细胞鉴定

1.2.2.1Ⅷ因子相关抗原(vwf)检测取原代培养细胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，终止后移入离心管离心(1 000 r/min，5 min)，EGM-2培养基重悬，并移入10 cm培养皿中的载玻片上，放入37℃、CO2培养箱爬片。24 h后去上清，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS冲洗3遍，加封闭液室温30 min，PBS冲洗，加一抗兔抗人vwf多克隆抗体4℃过夜，空白对照组使用PBS作为一抗。过夜后PBS冲洗3遍，加二抗37 ℃放置30 min，DAB显色试剂盒显色2 min加蒸馏水终止，镜下观察。

1.2.2.2VEGFR-2检测操作方法同上，一抗选择兔抗人 VEGFR-2抗体(武汉博士德生物公司)。二抗选择聚合HRP标记抗兔IgG，空白对照选择PBS作为一抗，镜下观察。

1.3MTT法测定婴儿血管瘤内皮细胞生长曲线取第2代细胞，均匀铺入96孔板，每孔2×104个，加入EGM-2培养基200 μL，孵育24 h后换液。每日检测1列8孔细胞。每日每孔加入MTT(5 mg/L)溶液20 μL，继续培养4 h，弃上清，加150 μL DMSO，震荡10 min。使用酶标仪(Thermo，美国)490 nm波长测每孔吸光度A，连续10 d。以时间为横坐标，平均吸光度A为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4异丙肾上腺素对细胞生长曲线的影响

1.4.1含异丙肾上腺素培养基的配制用EGM-2培养基稀释异丙肾上腺素，配制浓度分别为5、10、20 mg/L及50、100、200 mg/L的含有异丙肾上腺素培养基备用。所有操作均在超净台内完成。

1.4.2异丙肾上腺素对血管瘤内皮细胞的影响取第2代细胞消化离心并计数，然后均匀铺入96孔板，每孔2×104个，加入EBM-2培养基200 μL，孵育24 h，细胞贴壁后换液，换为含有异丙肾上腺素的浓度分别为5、10、20 mg/L(低浓度组)及50、100、200 mg/L(高浓度组)的培养基，同时设空白EGM-2(不含异丙肾上腺素)为空白对照组。每组设4个复孔。放入CO2培养箱继续培养。分别于24、48、72、96 h使用MTT法测定其吸光度，以时间为横坐标，平均吸光度为纵坐标，分别做每个浓度的细胞生长曲线，并观察细胞形态学改变。使用多个相关样本测量的非参数检验比较每个浓度组及空白对照组吸光度的差异，统计软件使用SPSS 17.0。

2结果

2.1血管瘤内皮细胞原代培养血管瘤内皮细胞原代培养24 h后观察，逐渐贴壁，呈类圆形至多角形。生长第2~3天后，数量逐渐增多。第4~5天细胞逐渐融合，呈多角形，但数量不超过50%。第8~9天，细胞逐渐成梭形及条索形，部分部位可见有类似血管结构形成。细胞铺满瓶底80%以上传代(图1、2)。

2.2血管瘤内皮细胞鉴定

2.2.1Ⅷ因子相关抗原(vwf)检测使用免疫组化方法染色后显微镜下观察，细胞呈多角形、梭形，胞浆着色呈棕黄色，细胞核未染色，呈阳性(图3)。

2.2.2VEGFR-2检测使用免疫组化方法染色后显微镜下观察，细胞呈多角形、梭形，胞浆着色呈棕黄色，细胞核未染色，呈阳性(图4)。

2.3血管瘤内皮细胞生长曲线的测定使用MTT法测定血管瘤内皮细胞生长曲线，结果显示第1~2天细胞吸光度平均值A增长缓慢，第3~5天迅速增长，第6天轻度下降，第7~8天再次上升达到平台期，第9~10天逐渐下降(图5)。

图1血管瘤内皮细胞原代培养

图2血管瘤内皮细胞第2代

图3Ⅷ因子相关抗原免疫组化(DAB显色×10倍)

图4VEGFR-2免疫组织化学检测(×10倍)

图5　第2代血管瘤内皮细胞生长曲线(MTT法)

2.4异丙肾上腺素对血管瘤内皮细胞的影响低浓度组各组24~72 h的吸光度值无明显差异(P>0.05)，但在96 h时发现，低浓度组与空白对照组的吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较后发现浓度越高，测得的吸光度值越高(P<0.05)，制作每组细胞吸光度的堆积折线图(图6)，显示低浓度药物对血管瘤内皮细胞具有刺激作用，并且浓度越高，其刺激作用越强。与空白对照相比，高浓度组细胞的吸光度值差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较后各浓度组吸光度值各不相同，浓度越高所测得细胞的吸光度值越低，提示高浓度的药物对细胞生长呈现抑制作用，并且浓度越高，抑制作用越强(图7)。

图6　低浓度组异丙肾上腺素影响下血管瘤内皮细胞吸光度折线图

图7　高浓度组异丙肾上腺素影响下血管瘤内皮细胞吸光度折线图

3讨论

目前皮肤脉管组织肿瘤的命名很不一致，特别是血管组织肿瘤分类各不相同，迄今仍不十分满意。1996年国际脉管性疾病研究学会将血管胎记分为两大类：血管肿瘤和血管畸形[2]。血管肿瘤是以内皮细胞增殖为特点，包括婴儿血管瘤、晚发性化脓性肉芽肿以及其他发生在婴幼儿期的罕见血管瘤，而血管畸形是血管形态发生中的异常。其好发于新生儿期，与婴儿血管瘤不同，血管畸形在出生后第1年中不迅速增长也不自发消退。而国内较为常用的是将皮肤血管瘤分为鲜红斑痣、海绵状血管瘤、草莓状痣及混合型等等[3]。婴幼儿血管瘤分为增生期、稳定期、退化期。增生期一般是指从出生后开始，一般持续6～10个月，在此期间内血管瘤不断增生扩展，迅速向周围皮肤及深层组织侵犯。稳定期一般持续3～6个月，此期内血管瘤增长速度逐渐缓慢，随着幼儿生长，血管瘤缓慢增长，但增长速度仍比小儿生长快，血管瘤增生和退化交替进行。一般1岁以后血管瘤增长速度缓慢下来，部分毛细血管瘤开始退化，血管瘤内纤维脂肪组织增多，毛细血管瘤颜色从紫红色或深红色转变为淡紫红色，以后颜色逐渐变浅退变为灰色，外形由饱满隆起转变为扁平至皱缩，皮肤组织纤维化。

本研究选择增生期婴儿血管瘤为研究对象，取手术切除标本做血管瘤内皮细胞的原代培养，使用LONZA公司(瑞典)的EGM-2培养基进行培养。目前对于血管瘤发生机制的研究认为生长因子对于血管瘤的形成起到非常重要的作用，例如血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子、人胰岛素样生长因子等[4-6],而本研究培养基内所含有的各种生长因子能够选择性促进血管瘤内皮细胞的生长。因此在进行血管瘤内皮细胞原代培养时除选材为增殖期的血管瘤标本外，普通培养基不能满足细胞生长的需要，而需要选择含有特殊细胞因子的培养基。本研究行血管瘤内皮细胞原代培养后经鉴定为血管瘤内皮细胞。

本研究所培养的血管瘤内皮细胞生长曲线的测定也呈现第1~2天缓慢，第3~5天迅速增长，第6天轻度下降，第7~8天再次上升达到平台期，第9~10天逐渐下降，呈现双峰。

2008年法国Bordeaux儿童医院Léauté-Labrèze等[1]报道，在使用心得安治疗1例伴有重症血管瘤的心肌病和另1例伴血管瘤的心输出量增加患儿时，意外地发现血管瘤萎缩变小。随后心得安逐渐被医生接受并广泛用于血管瘤患儿，取得良好的疗效, 异丙肾上腺素属于β-受体拮抗剂，与心得安的作用相拮抗，因此β-肾上腺素受体的作用受到广泛的关注。Ji等[7]报道异丙肾上腺素在体外能够促进血管瘤内皮细胞的生长。本研究针对异丙肾上腺素对血管瘤内皮细胞的作用展开了进一步的研究，探讨不同药物浓度对于血管瘤内皮细胞生长曲线的影响。结果显示低浓度的异丙肾上腺素对增殖期婴儿期血管瘤内皮细胞的生长呈现刺激作用，而高浓度(10倍)异丙肾上腺素对增殖期婴儿期血管瘤内皮细胞的生长呈现抑制作用，提示异丙肾上腺素对增殖期婴儿血管瘤内皮细胞的生长的影响受药物浓度的影响。推测低浓度异丙肾上腺素对于血管瘤内皮细胞的刺激作用体现了药物本身通过β-肾上腺素受体的作用而对血管瘤内皮细胞的促进作用，该结果与文献[7]报道一致。而其与心得安的对血管瘤内皮细胞的抑制作用互为拮抗，呈现镜像关系，由此推测β-肾上腺素受体在婴儿血管瘤内皮细胞的发病机制中起到重要作用，而高浓度的异丙肾上腺素对增殖期血管瘤内皮细胞呈现的抑制作用机制还需要进一步的研究。

参考文献：

[1]Léauté-Labrèze C, Dumas de la Roque E, Hubiche T, et al. Propranolol for severe hemangiomas of infancy[J]. N Engl J Med, 2008, 358(24): 2649-2651.

[2]Enjolras O, Mulliken J. Vascular tumors and vascular malformation, new issuses[J].Adv Dermatol, 1998,13:375-423.

[3]王侠生，廖康煌. 皮肤病学[M].上海：上海科学技术文献出版社,2005:7.

[4]Takahashi K, Mulliken JB, Kozakewich HP, et al. Cellular markers that distinguish the phases of hemangioma during infancy and childhood[J]. J Clin Invest,1994, 93: 2357-2364.

[5]刘江斌,肖现民,盛民立.雌激素和血管内皮细胞生长因子促进血管瘤增殖的体外实验研究[J].中华小儿外科杂志，2004,25(3):231-234.

[6]陈增红，曹东升，汪春兰，等.胰岛素样生长因子2及其受体在血管瘤和血管畸形中的表达[J].安徽医科大学学报，2010,45(1):73-75.

[7]Ji Y, Chen SY, Li K, et al. The role of β-adrenergic receptor signaling in the proliferation of hemangioma-derived endothelial cells[J]. Cell Div, 2013, 8(1):1.

(本文编辑王艳)

通信作者：赵今，女，博士生导师，主任医师，教授，研究方向：龋病学的防治研究,E-mail:merryljin@sina.com。