养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表达的影响



养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表达的影响

李点1，王超群2，廖亮英1，胡平2，彭银艳2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

〔摘要〕目的研究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38（p-p38MAPK）表达的影响。方法将60只SD雄性大鼠随机分为5组（正常组、假手术组、养阴润目丸组、新泪然组、模型组），每组12只。除正常组与假手术组外均采用去势法制造干眼模型。造模成功后一周开始分别给药治疗。用药3个月后，分别进行泪液分泌试验（SIT）及泪膜破裂时间（BUT）的检测，取大鼠结膜上皮细胞，采用免疫组化法检测p38MAPK的表达，采用Western blot法检测ICAM-1、p-p38MAPK的表达。结果与模型组比较，养阴润目丸组SIT明显增多，BUT明显延长；养阴润目丸可显著减少结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表达，差异有统计学意义（P<0.01）。结论养阴润目丸可有效改善眼表症状，增加泪液分泌量，延长泪膜破裂时间，下调结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表达。提示干眼的发病机制与炎症及p38MAPK信号通路相关，养阴润目丸对干眼的治疗具有一定的应用前景。

〔关键词〕干眼；养阴润目丸；结膜上皮细胞；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

Effects of Yangyin Runmu Pills on the Expression of ICAM-1, p38MAPK and p-p38MAPK in Conjunctival Epithelial Cells of Dry Eye Model Rats

LI Dian1, WANG Chaoqun2, LIAO Liangying1, HU Ping2, PENG Yinyan2

(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

〔Abstract〕Objective To study the effect of Yangyin Runmu Pills on the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), p38mitogen-activated Protein kinase (p38MAPK), phospho-and mitogen activated protein kinase p38antibody (pp38MAPK) in conjunctival epithelial cells of dry eye model rats. Methods Sixty Sprague -Dawley (SD) male rats were randomly divided into five groups (the normal group, sham operation group, Yangyin Runmu Pills group, Xinleiran group, model group), and 12rats in each group. All groups except for the normal group and sham operation group were prepared as the dry eye models by using the method of ovariectomy. After one week, the rats were treated with medicines. After three months treatment, schirmer tear test (STT) and tear film breakup time (BUT) of rats were detected. Theconjunctival epithelialcells were taken to test the expressive activities of p38MAPK by immunohistochemical methodand ICAM-1and p-p38MAPK by Western blot. Results Compared with the model group, SIT of Yangyin Runmu Pills group was increased obviously, BUT was extended obviously and the expressions of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cellswere decreased evidently, the differenceswere statistically significant (P<0.01). Conclusion Yangyin Runmu Pills can improve the symptoms of ocular surface, increase the tear secretion,prolong appears broken, and down -regulatethe expression of ICAM-1, p38MAPK, p-p38MAPK in conjunctival epithelial cells, which suggests that the pathogenesis of dry eye is related with inflammation and p38MAPK signaling pathway, and Yangyin Runmu Pills have potential application fortreating dry eye.

〔Keywords〕dry eye；Yangyin Runmu Pills；conjunctival epithelial cell；ICAM-1；p38MAPK；p-p38MAPK

干眼，中医称为“白涩症”，又名“干涩昏花症”及“神水将枯症”,是目前最常见的眼科疾病之一。相关研究显示[1-2]在中国干眼发病率为17.0%，中国北部和西部地区的年龄超过60岁的女性群体干眼发病率高达31.3%和34.4%，而在东南地区发病率约为9.54%，且女性明显高于男性。因此探索干眼发病机制及治疗方法正逐渐成为当前的研究热点。已有研究证明[3-6]，炎症在干眼的发病机制中具有重要作用，且与MAPK信号通路激活相关。本课题组前期研究表明[7]，用经验方养阴润目丸（原名“滋阴润目丸”）治疗干眼，在改善患者主观症状及增加泪液分泌等方面具有较好的疗效，但其具体作用机制不明。因此本研究拟通过复制大鼠干眼模型，探究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK表达的影响，为该方的临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康，无眼部疾患，1月龄SD雄性大鼠60只，体质量120～150g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2011－0003。泪液分泌试验(schirmer I test,SIT) ≥10mm/5min和泪膜破裂时间(break-up time, BUT)≥10s的动物方可使用。每4只1笼，常规饲料喂养，控制室温25℃左右，湿度55%左右。

1.1.2主要药物养阴润目丸（湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供）方药组成：生地黄，当归，枸杞子，沙参，白芍等。新泪然滴眼液（Alcon Laboratories，Inc；批号:219429F）主要含右旋糖酐、羟丙甲纤维素，甘油等。

1.1.3主要试剂p38（武汉博士德，BA1325－2）；ICAM（武汉博士德，A2189）；β-actin（Epitmics，1854-1）；羊抗鼠HRP标记二抗（碧云天，A0216）；RIPA组织细胞快速裂解液（上海基尔顿生物，BYL40825）；BCA蛋白定量试剂盒（thermo，PICPI23223）；蛋白预染Marker（Fermentas，SM1811）；NC膜（Millipore，HATF00010）；即用型SABC免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥，SA1022）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥，AR1022）。

1.1.4主要仪器研究型正置显微镜（麦克奥迪实业集团公司）；泪液检测滤纸条（天津晶明新技术开发有限公司，批号：20120707）；mini protean 3cell电泳仪型号（BIO－RAD公司)；HI1210型号水浴锅（Leica公司,）；暗匣（粤华医疗器械）。

1.2方法

1.2.1分组及造模SD大鼠60只（120眼），采用随机数字法分为5组（正常组A、假手术组B、养阴润目丸组C、新泪然组D、模型组E），每组12只（24眼）。参照实验动物模型的制作[8-10]，将C，D，E组大鼠切除睾丸及附睾，B组只切开阴囊而不切除睾丸及附睾，A组不做任何处理。

1.2.2给药方法造模后1周，待伤口基本愈合开始给药。C组采用生理盐水滴眼，滴双眼，1滴/次，3次/d，养阴润目丸与生理盐水按9g/100mL比例配置灌胃，1mL/100g，1次/d；D组采用新泪然滴眼液滴眼，滴双眼，1滴/次，3次/d，并用生理盐水灌胃，1mL/100g，1次/天；A、B、E组三组用生理盐水分别灌胃与滴眼，用量及频次同C、D组，连续给药3个月。（根据等效剂量换算公式D2=D1×R2/R1，按60kg成人每天药量9g，大鼠140g体质量为标准，《常用实验动物与人的体表面积比值表》查表得R1=346.68，R2=5.55，得实验大鼠给药剂量D2=9× 5.55÷346.68=0.14g，按大鼠1mL/100g灌胃，养阴润目丸与生理盐水按9g/100mL比例配置）。

1.2.3SIT试验及BUT测定根据预实验结果显示大鼠正常泪液分泌量比正常人少，以5mm×35mm大小滤纸条检测，长度仅能达到被折弯的5mm左右，为了减少实验误差，参照文献[11]，将其剪成两半，即2.5mm×35mm大小，一端折弯5mm，置于大鼠下睑内1/3结膜囊处，5min后测量滤纸条浸湿长度（不包括反折部分）。BUT测定：用玻璃棒蘸取1%荧光素钠滴于大鼠下眼睑结膜囊内，人工瞬目后于裂隙灯下用钴蓝光扫描照射，记录角膜第一个黑斑出现的时间。

1.2.4标本取材治疗3个月后，将3mm×3mm大小的乙酸纤维素薄膜纸条一角，轻轻置于大鼠颞侧球结膜表面，用玻璃棒轻压3～5min后取出，贴于5mm×5mm大小防脱氨基载玻片上，重复取标本2次，待薄膜稍干后，置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2.5免疫组织化学染色检测p38MAPK①涂片用蒸馏水洗2min×2次；②3%H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；③蒸馏水洗2min×2次；④PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑤滴加一抗p-p38MAPK（1∶100稀释）后37℃孵育2小时，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑥滴加相应生物素化二抗，37℃孵育20min，PBS（PH 7.2-7.6）洗2min×3次；⑦滴加试剂SABC，37℃孵育30min，PBS（PH 7.2～7.6）洗2min×3次；⑧DAB显色：室温条件下显色，镜下控制反应时间，自来水充分冲洗；⑨苏木素复染，中性树胶封片。

1.2.6细胞计数方法高倍镜下每个涂片至少观察5个视野以上，计数格内细胞总数，以细胞膜和细胞浆有明显的棕黄色或棕褐色为阳性，计算阳性细胞比率。

1.2.7Western检测ICAM-1、p-p38MAPK1①样品准备将组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12000r/min离心15min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱；②蛋白定量；③PAGE胶的制备；④上样及电泳；⑤转膜；⑥膜上蛋白的检测；⑦膜的封闭及抗体孵育封闭：5%脱脂奶粉（检测磷酸化蛋白用BSA）室温封闭1h。一抗：根据说明书P381∶150ICAM1∶200β-actin 1∶1000稀释抗体,抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2h。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤5min×3次。随后根据用量，按照1∶1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤5min×3次；⑧显色；⑨ECL化学发光检测。

1.3统计学方法

根据详细的数据资料，用SPPS 17.0软件进行统计学处理，实验数据以“±s”表示。符合正态性和方差齐性时,则用多因素方差分析两两比较法；不符合正态性和方差齐性时，则用非参多重比较法。均以P＜0.05（双侧检验）为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SIT、BUT的测定结果

各组大鼠治疗前后SIT及BUT检测，组内比较：A、B两组治疗前后比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；C、D、E三组用药前后比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。组间比较：同一时间段A组与B组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；A、B两组分别与C、D、E三组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；治疗前C、D、E三组之间分别比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；治疗3月后E组与C、D两组分别比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；C组与D组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1　各组大鼠治疗前后SIT、BUT测量值比较　(±s）

表1　各组大鼠治疗前后SIT、BUT测量值比较　(±s）

注：组间比较与A、B组分别比较，△△P＜0.01；与E组比较☆☆P＜0.01；治疗前后比较◇P＜0.05。

A组B组C组D组E组组别n BUT(s)治疗前　治疗3月后12.48±1.01　12.25±1.0712.46±1.03　12.25±1.028.41±0.79△△9.61±0.82△△☆☆◇8.09±0.81△△9.12±0.69△△☆☆◇8.22±0.71△△6.21±0.72△△◇1212121212SIT（mm）治疗前　治疗3月后11.9±1.32　11.8±1.2711.7±1.37　11.6±1.368.0±1.07△△9.6±1.04△△☆☆◇7.8±1.15△△9.0±1.37△△☆☆◇8.0±0.98△△6.4±0.84△△

2.2各组大鼠结膜上皮细胞的p38MAPK表达的比较及病理形态学改变

去势造模3个月后，A组和B组结膜上皮细胞呈扁平形，核居中，形圆，胞膜清晰，细胞膜和细胞浆内几乎无明显的棕黄色或棕褐色，p38MAPK蛋白表达含量极少，即无p38MAPK阳性表达。E组结膜上皮细胞的细胞膜和细胞浆中有大量棕黄色沉着，即p38MAPK大量阳性表达，其中，结膜上皮细胞部分核固缩崩解、消失，不同程度角化。C组和D组可见p38MAPK有表达，C组的结膜上皮细胞的棕黄色颗粒沉着程度较D组低，但两组比较无统计学意义。见表2、图1。

表2　各组大鼠结膜上皮细胞中p38MAPK阳性细胞比率　(±s）

表2　各组大鼠结膜上皮细胞中p38MAPK阳性细胞比率　(±s）

注：与A、B组分别比较△△P＜0.01；与E组比较☆☆P＜0.01。

组别np38MAPK阳性细胞A组B组C组D组E组12121212120.086±0.0420.124±0.0460.309±0.070△△☆☆0.354±0.066△△☆☆0.471±0.060△△

图1　各组大鼠结膜上皮细胞中p38MAPK表达光镜图(DAB，×400)

2.3各组大鼠结膜上皮细胞中ICAM -1、p -p38MAPK表达的比较

A、B组结膜上皮细胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量少，即无阳性表达，而C、D、E组结膜上皮细胞中ICAM-1、p-p38MAPK大量阳性表达；C、D组结膜上皮细胞中ICAM-1、p-p38MAPK蛋白含量明显低于E组（P＜0.01）；C、D组两组间差异不显著（P＞0.05），见表3、图2-3。

表3　各组大鼠结膜上皮细胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表达水平　(±s）

表3　各组大鼠结膜上皮细胞ICAM-1、p-p38MAPK蛋白表达水平　(±s）

注：与A、B组分别比较，△△P＜0.01；与E组比较,☆☆P＜0.01。

组别A组B组C组D组E组n 1212121212ICAM-10.129±0.0350.161±0.0480.471±0.141△△☆☆0.504±0.206△△☆☆0.875±0.412△△p-p38MAPK 0.082±0.0350.150±0.0700.361±0.113△△☆☆0.305±0.064△△☆☆0.474±0.099△△

3　讨论

干眼在中医古籍中有不同的命名，但机理基本是一致的。《审视瑶函》将其称为“神水将枯”、“白涩症”等，而《证治准绳》将其归于干涩昏花症。《诸病源候论》曰：“目，肝之候也，脏腑之精华，崇脉之所聚，上液之道，其液竭者，则目涩。”五脏充和，化生有源，津液在目化为神水，润泽目珠，濡养眼球。阴血亏虚，津液亏乏，则泪液生化之源不足，目失泪水濡润而生燥，导致干眼的发生。《目经大成》认为“此脏衰火作，虽真元未必遽绝，而自致之邪妄耗膏液。”指出干眼是由肝肾亏虚，津液亏损，虚火上炎，或郁热化火，上攻于目，灼津耗液，目失濡养所致。由此推测在干眼复杂的发病机制中，肝肾不足，津液亏虚，目失润养是其主要病机。笔者根据多年的临床经验,强调干眼与脏腑功能失调关系密切。认为人身津液之化生，源于脏腑，滋养眼球，圆润如珠，则发挥视物察色功用，脏腑功能失调，气血不足，气机不畅等均引起干眼，治疗应注重整体观念和辨证施治，坚持以八纲辨证和脏腑辨证合参，自拟养阴润目丸治疗干眼兼口干唇燥、头晕眼花、腰酸腿软、记忆力减退、舌红苔薄少津、脉细，属肝肾亏虚者，疗效颇捷。养阴润目丸方中以生地黄、当归、枸杞子为君，滋补肝肾；沙参、白芍、石斛、桑椹子、黄精具有益胃生津、滋阴清热、清心除烦、补肾益精、养肝明目之功效，与君药配伍具有增水行舟之功，以缓解肝肾不足引起的干眼症状，共为臣药，君臣共奏滋阴补肾、生津养血之功；佐以牡丹皮清热凉血；菊花清热解毒，平肝明目；黄芪益气明目。本方以补为主，以清为辅，补清相合，补中有清，补中有散，滋补而不腻，清散而不过，为治疗干眼症的有效方剂。

图2　各组大鼠结膜上皮细胞ICAM-1蛋白表达

图3　各组大鼠结膜上皮细胞p-p38MAPK蛋白表达

已有研究表明[12-13]，干眼发病的共同机制是基于免疫的炎症反应，众多细胞因子的交互作用参与了干眼的发病过程。各类炎性细胞的浸润和细胞炎性因子的释放，可通过细胞信号转导通路将信息传递至细胞核内，调控相关基因和蛋白的表达，进而对结膜细胞的生长周期、形态及功能产生影响。ICAM-1与干眼的损害程度呈正相关，并与T淋巴细胞渗透有关，其过度表达是由免疫反应中的炎症因子激活，也是眼表炎症的标志之一[14]。而p38MAPK被认为是炎症反应中最重要的激酶，主要参与应激条件下细胞的免疫调节。p38MAPK的活性对正常的免疫与炎症反应至关重要[15]，可以调控多种细胞因子、转录因子及细胞表面受体的表达，如IL-l、IL-6、TNF-α等。已有研究证实[16]，p38MAPK抑制剂SB203580可明显减少炎性因子的生成，从而减轻过度的炎性反应。因此，通过干预p38MAPK信号转导通路中相关信号分子的表达，就有可能对炎症通路的信号转导起到阻断作用，从而抑制相关炎症反应。

通过研究观察发现，养阴润目丸能有效增加实验大鼠泪液分泌量，延长泪膜破裂时间，与模型组比较有显著性差异，即通过去势法造成的干眼模型是成功的。去势造模三组分别同正常组、假手术组比较，大鼠结膜上皮细胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的阳性表达率均有显著性差异，即大量阳性表达，再次印证p38MAPK通路与干眼关系密切。用养阴润目丸治疗的大鼠结膜上皮细胞中的ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的阳性表达率明显低于模型组，且结膜上皮细胞的形态较之规则，着色程度较低，角化程度也明显低于模型组，表明养阴润目丸能有效下调结膜上皮细胞中p38MAPK蛋白的表达，从而抑制炎性反应，有效维持结膜上皮细胞正常的生长周期、形态及功能。实验结果证实养阴润目丸通过下调干眼大鼠结膜上皮细胞中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白含量，从实验层面证明了养阴润目丸治疗干眼的有效性，其抑制炎症、干预p38MAPK信号通路中关键信号分子的结果，均提示是养阴润目丸治疗干眼的作用机制。

根据以上结果认为，养阴润目丸能有效治疗干眼的机制可能是通过干预p38MAPK信号通路中ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK的表达，来阻断相关炎症反应途径，从而改善眼表干燥状态。但是，ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK与p38MAPK信号通路上游或下游的相关信号分子的关系及调节机制如何有待进一步明确。根据对各组结膜上皮细胞的形态学观察，是否有细胞凋亡等多重机制参与干眼发生发展有待进一步分析。

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（本文编辑李杰）

〔作者简介〕李点，女，主任医师，教授，硕士研究生导师，研究方向；眼表疾病的中西医防治。

〔基金项目〕湖南省自然科学基金资助项目（13JJ6063）；湖南省中医药科研计划项目（2015117）。

〔收稿日期〕2015-09-06

〔中图分类号〕R285.5；R276.7

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.004