针刺对脑缺血再灌注大鼠相关miRNA数目的影响



·针推经络·

针刺对脑缺血再灌注大鼠相关miRNA数目的影响

陈文，林亚平，杨茜芸，刘琴，肖姮，田浩梅*

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙410208）

〔摘要〕目的观察针刺疗法对脑缺血再灌注大鼠相关miRNA数目的影响。方法参照ZeaLonga线拴法复制大脑中动脉缺血模型(MCAO)并加以改良，将40只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组，治疗72h后，用基因微阵列技术筛选差异表达miRNA，并对神经功能缺损评分、TTC染色检测的梗死面积比进行比较。结果与空白组及假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分，梗死面积比增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；针刺治疗组相对应指标则不同程度地降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与空白组比较，模型组有4个差异基因表达；与假手术相比，模型组有5个差异基因表达；与模型组相比，针刺组有个16差异基因表达；差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论针刺疗法可改善神经功能缺损，减少脑梗死面积及细胞凋亡，对脑组织起保护作用，其机制可能与针刺疗法调节相关的miRNA有关。

〔关键词〕针刺；脑缺血再灌注损伤；miRNA

Effects of Acupuncture on the Number of miRNA in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats

CHEN Wen，LIN Yaping，YANG Qianyun, LIU Qin，XIAO Heng，TIAN Haomei*

(Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

〔Abstract〕Objective To observe the effect of acupuncture therapy on the number of miRNA in cerebral ischemia reperfusion rats. Methods Focal cerebral ischemia model was prepared with modified ZeaLonga' suture method. 40rats were randomly divided into 4groups，the blank group,the model group,the sham operation group,the acupuncture group,10in each group．After 72h treatment, the number of RNA express wasdetected with gene chip technology. The neurological function defect score and infarct size were compared. Results Compared with the blank group and sham operated group, the neurological deficit score and infarct area in the model group were significantly increased, the difference was statistically significant (P <0.05). The relative indexes of the acupuncture treatment group were decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the blank group, there were 4differential gene expressions in the model group, compared with the sham operation, the model group had 5different gene expressions. Compared with the model group, the acupuncture group had a 16difference genes expression, the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion Acupuncture theapy can improve the neurological deficit, reduce the area of cerebral infarction and cell apoptosis, protect brain tissue, and its mechanism may be related to the regulation of related miRNA.

〔Keywords〕acupuncture; cerebral ischemia reperfusion injury; miRNA

脑缺血损伤主要有两类，缺血的原发性损伤与再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是指脑缺血致脑细胞损伤，恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而进一步加重的现象，是脑血管疾病发病的主要部分，且有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。其过程包含一系列复杂的病理生理变化，机制极其复杂[1-2]。缺血期发生的病理生理变化并不是完全定型和不可逆的，血液恢复灌流后形成内源性损伤因子，启动一系列的病理生理过程导致脑缺血损伤进一步加重，即存在“缺血再灌注损伤”机制[3]，这种损伤是脑血管疾病发病的主要原因。

脑缺血再灌注损伤机制极为复杂，许多基因的表达发生明显变化，某些蛋白的表达显著上调[4]。近年研究认为，MicroRNA（miRNA）可能同样参与了脑血管疾病的发生发展，许多研究显示，在脑缺血再灌注后，有许多miRNA发生了变化[5-6]，而且Shup-ing Xiao[7]对脑缺血的相关miRNAs进行协同网络分析，发现各个miRNAs有不同高度的相关性。

针刺疗法治疗脑缺血再灌注损伤疗效确切，但具体机制仍在进一步研究，本研究观察针刺治疗CIRI大鼠72h后的脑组织miRNA的表达谱变化，探讨针刺对脑缺血再灌注损伤的相关miRNA数目的影响。

1　材料与方法

1.1动物

SD健康雄性大鼠40只，清洁级，体质量（265± 15）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。许可证号SCXK(湘)2013-0004。

1.2试剂与仪器

10%水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）(WB1001,维尔生物科技有限公司)；1.5% 2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）溶液（C19H15,维尔生物科技有限公司）；4%多聚甲醛(WB0401，维尔生物科技有限公司)。

Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司），MIAS医学图象分析系统（北航公司），LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)，双极电凝器（上海医用激光仪器），HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅(上海南阳仪器有限公司)，脑槽、数位温度表（TES 1310TYPE-K），大鼠肛温温度计(JNT)。微循环泵（Atactic Technologies公司），激光扫描仪（GenePix 4000B，Molecular Device），Array-Pro图像分析软件（Media Cybernetics）。

1.3动物分组及造模

40只大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组，每组10只。空白组不予造模。模型组、针刺组参照ZeaLonga[8]线拴法复制大脑中动脉缺血模型(MCAO)并加以改良，以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔麻醉，颈正中切口，暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉（ICA），电凝交通动脉，结扎ECA后电凝，动脉夹夹闭CCA与ICA，在颈外剪一斜形小口，将0.28mm单丝尼龙鱼线头端5mm用石蜡包被，并于18mm长度处标记，从切口处插入，栓线长度自CCA分叉处约18～20mm（根据动物体质量而定），栓塞右侧大脑中动脉，局部喷洒青霉素注射液防止感染，然后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。缺血2h后小心抽出栓线，即形成再灌注模型。假手术组仅插入尼龙鱼线约10mm，不栓塞，其余步骤同手术组。

1.4造模后评分标准及入组标准

神经功能缺损评分标准[8]：0分，无神经功能损伤症状；1分，提尾时栓塞动脉对侧前肢不能伸直；2分，行走时向栓塞动脉对侧旋转；3分，行走时向栓塞动脉对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。各组大鼠于缺血再灌注2h时进行神经功能评分，剔除评分为0分和4分的大鼠，评分1-3分者入组。治疗72h后各组大鼠再进行一次神经功能评分。

1.5干预方法

空白组不做其它任何处理，其余各组待大鼠呼吸、心跳等生命体征稳定（造模后3h）以后，假手术组、模型组只捆绑不针刺；针刺组针刺相应穴位后捻转1min，15min后捻转1次，留针30min，12h/次，共治疗7次（疗程72h）。取穴标准参照《实验针灸学》及华兴邦制定的《实验动物图谱》，并模拟人体腧穴骨度分寸法量取。人中：唇裂鼻尖下1mm正中处。直刺1～2mm。百会：顶骨正中，平刺2mm。大椎：第7颈椎与第1胸椎间，背部正中，直刺3mm。

1.6TTC染色测梗死面积

治疗72h后，每组随机抽取5只大鼠，大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速断头取脑,用冰生理盐水冲洗后，迅速放入-20℃冰箱内冷冻15min左右,去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切四刀,切成五片,第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将切片置于1.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中（37℃）避光孵育15～30min，每隔5min翻动1次。染好色后，将其置于10%甲醛中固定。

1.7microRNA表达谱的检测

治疗72h后，每组随机抽取3只大鼠,微阵列实验由LC Sciences公司进行。微阵列实验使用4～ 8μg总RNA样品。使用Poly(A)聚合酶在总RNA 3'端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接（ligation）用于后续的荧光标记。杂交反应利用微循环泵（Atactic Technologies）的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行[9-10]。在微流体芯片上，每条检测探针都是由一个化学修饰核苷酸编码段[与目标microRNA互补（来源于miRBase，http://www.mirbase.org/）或是与其他RNA（质控或是客户定制序列）互补]和一个由聚乙二醇组成的间隔段（扩大编码段与基质的间距）组成。检测探针均使用PGR（photogenerated reagent）化学法进行原位合成。杂交解链温度是通过化学修饰检测探针进行平衡。杂交使用含有25%甲酰胺的100μL 6xSSPE缓冲液[0.90M氯化钠（NaCl），60mM磷酸氢二钠（Na2HPO4），6mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH 6.8]，杂交温度为34℃。RNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件进行图像数字化转换。数据分析首先是减除背景值，然后使用LOWESS过滤[11]（局部加权回归）进行信号归一化。

1.8统计学方法

数据用SPSS 17.0软件统计，行正态性、方差齐性检验；满足正态性、方差齐采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较；方差不齐采用Tamhane T2法进行两两比较。不满足正态性及方差齐者，用非参数检验,所有实验数据均用“±s”表示。P<0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1针刺对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响

针刺组治疗后比治疗前神经功能评分降低，差异具有统计学意义（P<0.05),治疗后,与空白组及假手术组比较，模型组、针刺组神经功能评分较高，差异具有显著统计学意义（P<0.01），与模型组比较，针刺组能降低神经功能评分,差异具有统计学意义（P< 0.05），如表1所示。

表1　针刺对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响(±s）

表1　针刺对脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响(±s）

注：与针刺组治疗前比较荭P<0.05；与空白组比较**P<0.01；与假手术组比较##P<0.01；与模型组相比&P<0.05。

组别空白组假手术组模型组针刺组n 10101010再灌2h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##1.40±0.516**##治疗72h后0.00±0.0000.00±0.0001.50±0.527**##0.80±0.422荭**##&

2.2针刺对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积的影响

与空白组及假手术组比较，模型组、针刺组梗死面积比均明显增加，差异有统计学意义（P<0.01），即成模后各组都出现神经细胞损伤；与模型组比较,针刺组梗死面积比减少,差异有统计学意义（P< 0.05）。如表2所示。

表2　针刺对脑缺血再灌注大鼠缺血侧梗死面积比的影响(±s）

表2　针刺对脑缺血再灌注大鼠缺血侧梗死面积比的影响(±s）

注：与空白组比较**P<0.01；与假手术组比较##P<0.01；与模型组比较&P<0.05。

组别n 脑梗死面积比空白组假手术组模型组针刺组55550.00±0.000.00±0.0033.43±5.64**##18.39±10.86**##&

大鼠脑组织切片经TTC染色后,红色为正常脑组织，白色为梗死区域。空白组和假手术组未见梗死灶,模型组可见大片白色梗死灶,证明造模成功，针刺组可见小片白色梗死灶。如图1所示，蓝色箭头所指为梗死灶。

图1　各组大鼠梗死面积TTC染色图

2.3针刺对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马组织miRNA表达谱的影响

差异基因(miRNA)的筛选：每组选择三个样本按随机方差模型进行两组样本间差异的筛选，利用随机方差模型计算每个基因(miRNA)的显著性水平(P值)，按照P<0.05进行筛选，获得差异表达的miRNA。我们在两组之间共发现32个差异miRNA，与空白组相比，模型组有4个差异基因，针刺组有5个差异基因；与假手术组相比，模型组有5个差异基因，针刺组有仍7个差异基因；与模型组相比，针刺组有16个差异基因；造模后有9个基因差异表达，针刺治疗后，有21个差异表达基因。差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

虽然在两组之间有众多的差异基因(miRNA)被发现，但并不是所有这些差异基因(miRNA)均参与疾病的发生和发展过程。其中有些与脑缺血再灌注损伤密切相关，需要我们进一步验证。

3　讨论

miRNA是一类高度保守的长约19～25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，其种类众多，表达具有一定的组织特异性。miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。在细胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理病理过程中，miRNAs的调节作用不容忽视。督脉属奇经八脉之一，是人体诸阳经脉总汇，对整个经脉系统有统帅作用，因此督脉与脑、脊髓等关系密切，故历代医家认为“病变在脑，首取督脉”。且课题前期研究表明：针刺百会、大椎、人中治疗72h能改善大脑中动脉闭塞后2h再灌注模型大鼠神经功能缺损、减少脑梗死面积等作用，从而对脑产生保护作用[12]，且其保护作用的实现为多途径、多靶点与多条信号的调整[13]。

近年研究发现在脑缺血再灌注后，有许多miR-NA发生了变化[5-6]，我们的研究发现，造模后，激活了9个差异表达基因，可能脑缺血再灌注损伤导致这些基因的差异表达，也可能是这些基因表达，通过促进神经细胞凋亡、激活某些通路、促进炎症水肿等加重脑细胞的损伤，针刺治疗后，共激活了21个差异表达基因。与造模后激活的差异基因有2个重复，重复的rno-miR-331-3p、rno-let-7d-5p我们在GO基因功能中发现，它们既能促进也能抑制细胞的凋亡，对脑缺血再灌注损伤的多方面都具有双向调节作用，可能针刺疗法能刺激以上这些miRNA，逆转有害的影响，保护脑组织。

表3　各组间差异基因表达（P<0.05）的数目及名称

也有研究认为[14]，造模后miRNA 290、miRNA 494会明显降低，针刺预处理能使其显著提高，本实验各组间比较中，没有一组出现miRNA 290、miRNA 494，这可能与不同研究者采用的动物模型、观察时间不同以及治疗手段的不同有关,可能还需要大量实验对脑缺血损伤的治疗方式、损伤变化做进一步的研究，使临床治疗更具靶向性。

针刺治疗缺血性脑损伤已被大量临床与实验所验证，证明针刺对脑缺血后的神经元具有保护作用，可以减轻脑水肿，减少梗死面积。我们验结果显示，造模成功后大鼠神经功能评分增加，梗死面积明显，针刺疗法能改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损、降低脑梗死面积。其疗效可能与针刺激活的21个差异基因的功能有关。本实验只做了一个广泛的筛选，各miRNA的功能、具体调控靶蛋白及其涉及的精准调控机制、相互之间的关联等还需进一步研究。

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（本文编辑匡静之）

〔通讯作者〕*田浩梅，女，副教授，E-mail：451358104@qq.com。

〔作者简介〕陈文，女，在读硕士研究生，研究方向：经脉-脏腑相关。

〔基金项目〕国家自然科学基金青年基金项目资助(81303051)；湖南省中医药科研计划项目（201471）。

〔收稿日期〕2015－09－24

〔中图分类号〕R245.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.017