白术七物颗粒对气阴两虚型STC大鼠结肠组织NSE的影响



白术七物颗粒对气阴两虚型STC大鼠结肠组织NSE的影响

谭蕊1，林仁敬2*，何永恒2

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208，2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005）

〔摘要〕目的研究白术七物颗粒对气阴两虚型结肠慢传输型便秘大鼠结肠组织神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）的影响，初步探讨白术七物颗粒对结肠慢传输型便秘的作用机制。方法将60只SD大鼠按照完全随机原则分为正常组、模型组、治疗组，每组各20只。正常组予以皮下注射等体积等渗生理盐水，模型组、治疗组予以皮下注射盐酸吗啡注射液2.5mg/(kg·d)，共45d，并同时灌服青皮（18g）、枳壳（18g）、附子（15g）溶液，建立气阴两虚型结肠慢传输型便秘模型。造模成功后各组分别予以相应药物进行灌胃治疗，每天1次，连续14d，末次给药后检测各组大鼠结肠组织中NSE的含量。结果造模前,各组大鼠粪便干重比较,差异无统计学意义；造模后，模型组、治疗组大鼠粪便干重与正常组比较明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；造模后,模型组、治疗组肠道炭末推进率与正常组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.01);模型组与治疗组大鼠结肠组织中NSE含量明显降低，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组与模型组相比，NSE含量相对升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论白术七物颗粒能有效治疗气阴两虚型结肠慢传输型便秘，其作用与提升NSE的含量关系密切。

〔关键词〕结肠慢传输型便秘；白术七物颗粒；气阴两虚型；血管活性肠肽；NSE

Effects of BaizhuQiwu Granules on the NSE in Colon Tissue of STC Rats with Deficiency of both Qi and Yin Syndrome

TAN Rui1, LIN Renjing2*, HE Yongheng2

(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China)

〔Abstract〕Objective To study the effect of Baizhu Qiwu Granules on neuron specific enolase (NSE) in colonic tissues of colon slow transit constipation rats with deficiency of both Qi and Yin syndrome and to explore its mechanism of action. Methods 60SD rats were randomly divided into normal group, model group and treatment group, 20rats in each group. The rats in normal group were given isovolumetric and isotonic normal saline in subcutaneous injections and the remaining rats in model and treatment groups were daily subcutaneous injection of 2.5mg/kg·d of morphine hydrochloride for total 45days, and at the same time administered with Qingpi (18g), Zhike (18g) and Fuzi (15g) to build thecolon slow transit constipation model rats with deficiency of both Qi and Yin syndrome.After establishing the models successfully, the rats in each group are given the corresponding drug treatment once daily for 14days. At the final injection,the level of NSE in colonic tissues of rats was measured. Results There was no significant difference in the dry weight of the feces of the rats in each group before building. After modeling, the dry weight of the feces of rats in the model group and the treatment group were significantly decreased compared with the normal group, the differences have statistical significance (P<0.01). The rate of intestinal charcoal propulsion in the model group and the treatment group were significantly decreased compared with the normal group, the differences have statistical significance (P<0.01). The content level of NSE in colon tissue of rats inthe model group and treatment group was increased compared to the normal group, the differences have statistical significance (P <0.05). The content level of NSE in colon tissue of rats in the treatment group was decreased compared to the normal group, the differences have statistical significance (P<0.05). Conclusion Baizhu Qiwu Granules can effectively treat both Qi and Yin type of colonic slow transit constipation,which may be related with the elevated NSE level.

〔Keywords〕slow transit constipation; Baizhu Qiwu Granules; deficiency of both Qi and Yin type; vasoactive intestinal peptide；NSE

结肠慢传输型便秘( slow transit constipation，STC)是一类主要以胃肠动力明显减弱为特点的顽固性便秘，迄今为止其病因仍不完全明确[1]。临床上常以便次减少、无便意、排便困难、排便不尽感为主要表现，症状顽固，治疗困难。目前其发病率有呈逐年上升的趋势，且有年轻化的趋向。本研究主要通过观察白术七物颗粒对气阴两虚型STC大鼠结肠组织神经元特异性烯醇化酶的含量影响，初步探讨白术七物颗粒对STC的治疗作用及其作用机制，为临床应用白术七物颗粒治疗本病提供初步实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级SD大鼠60只，雌雄各30只，体质量(210±6.5) g，均为湖南中医药大学动物实验中心代为购买,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。动物来源证号为：NO.43004700009363，于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室内饲养，室内自然光照明，温度(22±3)℃，相对湿度40%～70%。

1.1.2主要试剂及药物白术七物颗粒剂：广东一方制药有限公司生产;青皮、枳壳、附子配方颗粒：广东一方制药有限公司生产；盐酸吗啡注射液10mg/支：沈阳第一制药厂生产；神经元特异性烯醇化酶抗体:美国abcam公司生产，生产批号：09000284029。WB封闭液、Western抗体稀释液、蛋白印迹膜再生液、兔抗大鼠一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗、Western一抗、二抗稀释液：长沙来弗曼生物有限公司。

1.1.3器材设备电子精密天平(上海天平器械厂)；DYY-2C电泳仪(北京六一)；DYCZ-24DN垂直板电泳仪（北京六一）；VE 186转移电泳槽（上海天能）；WD-9405B水平摇床（北京六一）；Tanon 5500全自动化学发光成像系统（上海天能）；5424R台式高速冷冻离心机（Eppendorf）；酶标仪（上海沛欧分析仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1模型的制备实验前，将60只实验大鼠按照完全随机原则分为正常组、模型组、治疗组，均置于实验笼内3d，使其适应环境。模型组、治疗组参照文献[2]的方法予以皮下注射盐酸吗啡2.5mg/ (kg·d)，并参照文献[3]的方法同时灌服青皮18g、枳壳18g、附子15g，加开水100mL冲泡，制成浓度为1g/mL的水溶液，每天1次，每次灌服含生药量13g/kg体质量，随体质量增减调整剂量。正常组皮下注射等渗等体积生理盐水，连续45d，每天一次。观察造模期间大鼠的一般状况，并记录造模前、后24h各组大鼠粪便干质量。末次造模给药24h后，各组抽取5只大鼠分别经口灌入炭末混悬液1mL/ 100g体质量，30min后处死，立即解剖，截取直肠末端至幽门之间肠管，测量肠道全长及炭末推进距离，计算炭末推进率。

1.2.2模型成功判断标准造模后若模型组、治疗组大鼠出现懒动、毛色枯黄、抵抗微弱、尾巴暗、大便数量减少、颗粒变大且质硬等情况，而正常组大鼠运动灵活，饮食、饮水正常，大小便正常。且模型组与治疗组大鼠粪便干重与正常组比较明显减少，肠道炭末推进率与正常组比较明显降低，则表明模型复制成功。

1.2.3给药方法造模成功后，治疗组大鼠按照体表面积[4]换算成成人等效剂量，即灌服白术七物颗粒水溶液，用法：加开水100mL冲泡，制成浓度为2.0g/mL的水溶液，每天1次，每次灌服含生药量24g/kg体质量。其余两组予以等体积等渗生理盐水灌服，连续14d。实验期间，每隔2天称重1次，并根据体质量变化情况调整给药剂量，并给予所有大鼠自由饮水摄食，每3-5天清洗实验笼。

1.3观察指标及方法

1.3.1一般观察及大鼠粪便干重称量每天观察各组大鼠运动情况、饮食饮水情况、大便性状改变情况并予以记录，每天予电子精密天平称取各组大鼠粪便干重并予以记录。

1.3.2大鼠肠道炭末推进率测定末次造模给药24h后，各组抽取5只大鼠分别经口灌入炭末混悬液1mL/100g体质量，30min后处死，立即解剖，截取直肠末端至幽门之间肠管，测量肠道全长及炭末推进距离，计算炭末推进距离所占肠道全长比例,即炭末推进率。

1.3.3神经元特异性烯醇化酶的含量测定在给药14d后处死大鼠，将切取的部分结肠保存在装有甲醛溶液的试管内待测。用Western blot法检测神经元特异性烯醇化酶的含量。具体步骤如下：（1）组织样本蛋白提取：把组织剪切成细小碎片，按照比例加入裂解液；充分裂解后，12000转/min离心10min，取上清。（2）培养细胞蛋白提取：按照6孔板每孔细胞加入裂解液，冰上裂解30min，12000转/min离心10min，取上清。（3）SDS-PAGE电泳：电泳样品准备，上样前将样品与5×SDS上样缓冲液混匀于沸水中煮5～10min使蛋白变性；上样，开始电泳。（4）转膜：依据胶的大小剪取膜和6片滤纸，放入转移缓冲液中平衡10min。放入转移槽内，倒入电转移缓冲液，胶放于负极面。将转移槽置于冰浴中，插上电极，转膜约2h。（5）封闭：把蛋白膜放置到TBST中漂洗1～2min，移至用TBST配制5%脱脂奶粉的平皿中，室温下，脱色摇床上摇动封闭1～2h。（6）抗体孵育：把滤膜放入杂交袋中，加入用TBST稀释的一抗，4℃孵育过夜；剪开杂交袋，倾去一抗，用TBST漂洗3次，每次10min；将滤膜转移到新的杂交袋中，加入用TBST稀释的HRP标记二抗，室温孵育1h；剪开杂交袋，倾去二抗，用TBST漂洗3次，每次10min。（7）显色：ECL发光液显色：按试剂盒说明将ECL液SolA与SolB按1:1混匀，铺于膜上反应2min。在全自动化学发光成像系统中拍照，曝光：30、60、90s，保存图片。

1.4统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以“±s”表示，符合正态性，组内治疗前后比较用t检验，多组间比较采用多元方差分析；P< 0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2　结果

2.1一般观察

正常组大鼠运动灵活，饮食、饮水正常，大小便正常。模型组、治疗组大鼠造模后出现懒动、毛色枯黄、抵抗微弱、大便数量减少、颗粒变大且质硬等情况，解剖见粪便集中在结肠段，呈串珠状或球状，质干硬。各组大鼠饮食饮水变化不明显，体质量均正常增长，无明显差异。

2.2粪便干重比较

各组大鼠粪便干重造模前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，模型组、治疗组大鼠粪便干重与正常组比较明显减少，差异有显著统计学意义（P<0.01），见表1。

2.3肠道炭末推进率比较

造模灌胃治疗后各组随机抽取5只大鼠进行评估，模型组、治疗组与正常组比较大鼠肠道炭末推进率明显降低，差异有显著统计学意义(P<0.01)。治疗组与模型组比较大鼠肠道炭末推进率相对升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)，见表2。

表1　三组大鼠造模前与造模45d后粪便干重比较　(x±s，g)

表2　各组大鼠肠道炭末推进率比较　(±s）

表2　各组大鼠肠道炭末推进率比较　(±s）

注：与正常组比较**P<0.01；与模型组比较△△P<0.01。

组　别　n　药物剂量（g/kg）　肠道炭末推进率（%）正常组　5　-　77.19±8.00模型组　5　-　31.93±3.30**治疗组　5　24　46.41±3.18**△△

2.4各组大鼠治疗后结肠组织中NSE含量比较

模型组、治疗组与正常组相比，NSE含量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组与模型组相比，NSE含量相对升高，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表3。

表3　各组大鼠治疗后结肠组织中NSE含量水平(±s）

表3　各组大鼠治疗后结肠组织中NSE含量水平(±s）

注：与正常组比较*P<0.05；与模型组比较△P<0.05。

组别　n　药物剂量（g/kg）　NSE正常组　15　-　57.14±5.49模型组　15　-　32.44±3.50*治疗组　15　24　47.18±6.77*△

3　讨论

STC是因结肠传输功能减弱致使肠内容物滞留于结肠而引起的顽固性便秘。目前临床上通常将功能性便秘分为三类：（1）慢传输型便秘；（2）出口梗阻型便秘；（3）混合型便秘[5]。STC占便秘的16%-40%，约占功能性便秘的45.5%，是临床上比较常见的一种类型。长期的慢性便秘不仅会给患者带来许多苦恼，并且还在结肠癌、肝性脑病、乳腺疾病、早老性痴呆等病的发病中起着推波助澜的作用。便秘甚至可以因诱发急性心梗或脑血管意外而直接危及患者生命。而目前对于STC的治疗尚无特效药，临床上病情顽固，治疗困难。现代医学采用内科治疗效果常不甚满意，手术治疗有严格的手术适应症且以后仍有一定的便秘复发率，并可能出现腹泻等并发症。与西医、西药相比，中医药治疗STC不但在通便方面有优势，同时，对紊乱的胃肠功能也进行了调整，使患者的体质情况得到改善,提高了患者的生活质量，在治疗便秘方面有广阔的发展前景。

关于模型复制方面：本研究中予以皮下注射盐酸吗啡注射液2.5mg/(kg·d)的剂量，45d后成功复制STC大鼠模型。同时灌服青皮、枳壳、附子45d，青皮、枳壳破气耗气，附子大辛大热、伤阴灼津，45d后成功复制气阴两虚型STC大鼠模型。此模型稳定性较好，安全性、成功率较高。

神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）存在于哺乳动物神经组织内的成熟神经元及神经起源的细胞之中，它是糖酵解过程中烯醇化酶的一种同工酶[6]，这种酶在体内具有重要的意义，在人类神经系统发育之时，当神经母细胞发育而成为神经嵴时，α烯醇化酶就转化为NSE，NSE作为神经节细胞的特异性标记物之一，它对判定神经节细胞的数量和成熟度具有很重要的意义。而且运用NSE特异抗体还可观察神经元及神经内分泌细胞的变化。故而NSE可作为神经系统是否成熟的标志。

白术七物颗粒剂是何永恒教授根据北京医院魏龙骧名老中医的白术汤合《卫生宝鉴》的沉香四磨汤化裁而来[7]，方中重用生白术益气健脾，为君药;生地黄为臣药，生津养血、滋阴清热;木香善行胃肠之气，且能助白术使脾气得运；槟榔尤擅行胃肠之气，消积导滞，兼能缓泻通便，为臣药;沉香擅降气温中;乌药擅行气温中；佐以升麻，升举阳气;诸药合用，益气养阴，降气运下，脾滞得运，腑气得通，便秘自除。本研究结果提示，运用白术七物颗粒治疗后，结肠组织中NSE含量相对升高，证明白术七物颗粒治疗STC的作用机理与升高NSE含量有密切关系。此实验也为临床使用白术七物颗粒治疗STC提供了实验依据。

参考文献：

[1]Andromanakos N，skandalakis P，Troupis T，et al. Constipation of anorectal outlet obstruction: pathophysiology，evaluation and management［J］.Journal of Gastroenterology and Hepatology，2006，21(4): 638－646.

[2]隋楠,田振国,等.助阳通便汤对慢传输型便秘模型小鼠结肠组织中5-HT受体、VIP分布和表达的影响[J].辽宁中医药大学学报，2014,14（5）：34－38.

[3]吴忆，李敬林，张锐，等.2型糖尿病气阴两虚证动物模型研究及反证中药对证候的影响[J].辽宁中医杂志，2005,32（7）：114－115.

[4]贺石林,王键,王净净,等.中医科研设计与统计学[M].长沙:湖南科学技术出版社,2001：48-49.

[5]申连东,马艳，齐文海，等.慢性便秘规范化治疗探讨[J].内蒙古中医药，2012,15：130－131.

[6]邱全曜，繆明永.神经元特异性烯醇化酶[J].生命的化学，2008,28（4）：439-442.

[7]何永恒，林仁敬，李正兴，等.2012医学前沿[M].北京:中医古籍出版社，2012:273－275.

（本文编辑杨瑛）

〔通讯作者〕*林仁敬，男，医师，E-mail:1093025592@qq.com。

〔作者简介〕谭蕊，男，硕士研究生，研究方向：中医药对肛肠疾病的防治与研究。

〔基金项目〕国家自然科学基金资助项目（81302977）。

〔收稿日期〕2015-05-19

〔中图分类号〕R285.5；R256.35

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.11.003