枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化

杨 婷，廖美德，贺玉广，刘偲嘉

（华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化

杨 婷，廖美德*，贺玉广，刘偲嘉

（华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

为研究初始pH、蛋白胨浓度和不同发酵底物对枯草芽孢杆菌生长的影响，对不同发酵底物进行液态和固态发酵试验，结果发现，pH为6.5～7.0时，细菌生长最快，pH为7.5～8.0时，蛋白酶的活性最强；蛋白胨1.6 g·L-1的LB培养基，枯草芽孢杆菌的生长状况最好，蛋白酶的活力也最强；豆粕是优质氮源，能显著促进枯草芽孢杆菌的生长和蛋白酶活性，豆粕20%、豆渣10%、麸皮60%和玉米粉30%作为固态发酵底物，枯草芽孢杆菌的生长速度最快，豆粕10%、豆渣10%、麸皮50%和玉米粉10%为固态发酵底物，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强。

枯草芽孢杆菌；发酵；正交实验

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性好氧型细菌，常作为益生菌添加在幼小动物日粮中，能够起到改善动物肠道菌群结构、提高消化酶活性、改善机体免疫功能以及提高生产性能的作用，对人畜无毒害作用，不污染环境[1-2]。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等，对提高动物的饲料转化率、促进营养的消化吸收和预防疾病起到重要作用[3-5]。目前，在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。本文在前人的研究基础上，以玉米粉、麸皮、豆粕、豆渣为原料，旨在寻找出一种高效经济的发酵底物，获得较高的枯草芽孢杆菌产量和酸性蛋白酶活力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种为枯草芽孢杆菌，华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点试验室保存；豆粕、豆渣和玉米粉均购买于广州市花鸟鱼虫市场。

培养基的制备。液体LB培养基：蛋白胨1 g、氯化钠1 g、酵母粉0.5 g、蒸馏水100 mL；固体LB培养基：液体培养基+2%的琼脂粉，121℃，灭菌20 min，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 初始pH对细菌生长和蛋白酶活性的影响

设置初始pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的液体LB培养基，每组设6组重复，2%的接种量接入枯草芽孢杆菌菌种，180 rpm恒温培养箱中培养24 h后，培养液稀释10倍测OD600。菌液5 000 rpm离心10 min，除去菌体，取上清液待用。用移液枪吸取上清液0.5 mL，注入奶粉-琼脂双层平板的点样孔之中，放置4和8 h后测量水解圈的大小，测定其蛋白酶活性。

1.2.2 蛋白胨对细菌生长和蛋白酶活性的影响

以液体LB培养基（蛋白胨浓度为10 g·L-1）为对照组，不同浓度蛋白胨的LB培养基为处理组，蛋白胨浓度设为12、14、16、18和20 g·L-1，每组设6个重复，试验操作同1.2.1。

1.2.3 豆粕、豆渣和玉米粉对枯草芽孢杆菌生长的影响

配制豆粕（豆渣、玉米粉和麸皮）培养基（固体∶水=1∶20），混合均匀，121℃，灭菌20 min，备用。液体LB培养基，每组设6个重复，试验操作同1.2.1，称取1 g发酵物用平板稀释法计算活菌数。

1.2.4 单因素正交实验

枯草芽孢杆菌发酵底物正交实验的因子与水平见表1。按照表1配制固体培养基，料水比为1∶1，加入1%氯化钠，搅拌均匀，121℃，灭菌20 min，备用。接种量V/M（V-液体种子体积数，M-固体发酵培养基的质量）为2%。常温发酵24 h后，称取 发酵物1 g，用平板稀释法计算活菌数。按照福林-酚试剂法测定蛋白酶活力。

表1 枯草芽孢杆菌发酵底物正交实验的因子与水平 %

1.3 统计分析

试验数据采用Dps 7.05软件进行显著性分析，并采用Duncan's新复极差法进行分析，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 初始pH对细菌生长和蛋白酶活性的影响

初始pH对细菌生长和蛋白酶活性的影响见表2。

表2 pH对细菌生长和蛋白酶活力的影响

由表2可知，不同初始pH对细菌生长和蛋白酶活性有一定的影响，在pH约6.5时细菌的生长速度最快，但蛋白酶活性最强时的pH为7.45。

2.2 蛋白胨对细菌生长和蛋白酶活性的影响

蛋白胨浓度对枯草芽孢杆菌生长和蛋白酶活性的影响见表3。

表3 蛋白胨浓度对枯草芽孢杆菌生长和蛋白酶活性的影响

由表3可知，蛋白胨16 g·L-1处理组较对照组细菌生长速度和蛋白酶活力都最好，差异显著（P＜0.05）。

2.3 不同培养基对细菌生长和蛋白酶活性的影响

豆粕、豆渣、玉米粉对枯草芽孢杆菌生长和蛋白酶活性的影响见表4。

表4 豆粕、豆渣、玉米粉对枯草芽孢杆菌生长和蛋白酶活性的影响

由表4可知，豆粕不仅是优质氮源，能显著促进枯草芽孢杆菌的生长（P＜0.05），同时对其蛋白酶活性影响更大。

2.4 正交实验

2.4.1 血球计数板测定枯草芽孢杆菌活菌数

活菌数正交分析表见表5。

表5 活菌数正交分析

从正交实验结果可知，影响细菌生长的主要因素影响力排列为麸皮＞豆粕＞玉米粉＞豆渣，最适培养基为豆粕10%、豆渣20%、麸皮60%、玉米粉20%。

2.4.2 蛋白酶活力测定结果

蛋白酶活力正交分析见表6。

由表6可知，影响酶活力的主要因素影响力为豆粕＞豆渣＞麸皮≈玉米粉，最适培养基为豆粕10%、豆渣10%、麸皮50%、玉米粉10%的酶活力达到最佳。

表6 蛋白酶活力正交分析

3 讨论

枯草芽孢杆菌作为益生菌微生态制剂因其绿色、安全受到了畜牧工作者的推崇。优良的微生态制剂必须有足够的活菌数量，为了尽量提高产品芽孢的数量,需要对其产芽孢的培养基进行系统优化,以降低生产成本,提高芽孢得率[6-7]。

种子培养基是供菌体生长繁殖用的，营养成分应易被菌体吸收利用，要较丰富和完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度略低为宜，以便菌体的生长繁殖。发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的，采用的原材料质量应相对稳定，同时不影响产品的质量，因此必须按照不同培养阶段的微生物生理学特性提供适宜的培养基配方[8-9]。枯草芽孢杆菌在种子培养过程中，试验中初始pH为6.5～7.0，细菌的生长速度是最快的；pH为7.5～8.0时，蛋白酶的活性最强；试验中蛋白胨16 g·L-1的培养基中枯草芽孢杆菌的生长最佳，并且蛋白酶的活力也最强。

碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢产物中的碳素来源，目前，世界上主要选用玉米粉作为枯草芽孢杆菌发酵的碳源[10]。氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的另一个主要因素，在芽孢的形成上也发挥着重要作用，枯草芽孢杆菌在生产中常用豆饼粉作氮源[11]。C/N直接影响菌体的生长和代谢，过高过低都影响细菌的生长和产物的合成[12]。本试验选用豆粕、豆渣、麸皮和玉米粉为发酵底物，结果表明，固体培养基中的麸皮含量对枯草芽孢杆菌的生长速度影响最大，以豆粕20%、豆渣10%、麸皮60%、玉米粉30%的固体培养基中枯草芽孢杆菌的生长速度最快；固体培养基中豆粕含量对枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力影响最大，以豆粕10%、豆渣10%、麸皮50%、玉米粉10%的固体培养基中枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强。

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Optimization of Solid-state Fermentation ofBacillus Subtilis

YANG Ting,LIAO Meide*,HE Yuguang,LIU Sijia

To study the effects of the initial pH,peptone concentration and different fermentation substrate on the growth of bacillus subtilis.For different fermentation substrate,liquid and solid state fermentation experiment was carried out.The result showed that the pH at the range of 6.5 to 7.0 made the bacteria grow fast,and pH 7.5 to 8.0 was better to protease activity.The bran content of the solid medium was the main factor for the bacillus subtilis growth,while 20%soybean meal,10%okara,60%wheat bran and 30%corn flour were the best substrate for bacillus subtilis growth;soybean played an important role on the activity of protease,while 10%soybean meal,10%okara,50%wheat bran and 10%corn flour as a fermentation substrate,the activity of protease would be strongest.

bacillus subtilis;fermentation;orthogonal test

S816.6

A

1001-0084（2015）03-0005-04

2015-01-27

广州市科技局项目（2008J1-C221）

杨婷（1990-），女，湖北孝感人，硕士研究生，研究方向为微生物代谢产物。

*通讯作者：副教授，硕士生导师，E-mail:meideliaotg@163.com。