基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

李天芝，于新友，李书光,2，苗立中,2，沈志强,2*

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600 2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

李天芝1，于新友1，李书光1,2，苗立中1,2，沈志强1,2*

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600 2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

根据地衣芽孢杆菌的gyrB基因序列设计一对引物，扩增片段大小为507 bp的基因片段，该方法对地衣芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性，对照菌株扩增结果均为阴性，对地衣芽孢杆菌检测的灵敏性为1 pg总DNA量，成功建立了地衣芽孢杆菌PCR检测方法，该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，为地衣芽孢杆菌的分离及鉴定奠定了良好的基础。

地衣芽孢杆菌；gyrB基因；PCR

地衣芽孢杆菌对葡萄球菌、酵母样菌等致病菌有颉颃作用，而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化性链球菌有促进生长作用，从而可通过调整菌群失调达到治疗目的，还可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。此外，地衣芽孢杆菌还可通过夺氧生物效应使肠道内缺氧，有利于大量厌氧菌生长，造成肠道低氧环境，对肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化链球菌等有益健康的厌氧菌生长繁殖有促进作用，对葡萄球菌、白色念球菌、酵母样菌等致病菌则有颉颃作用。通过这种双重作用可以调整肠道菌群失调，维持机体肠道微生态平衡，从而对肠道疾病达到治疗和预防的目的。普遍存在于细菌中的单拷贝gyrB基因，是编码促旋酶B亚单位的基因。gyrB基因能不断进化，替换0.7%～0.8%的碱基大约需要的时间是100万年，可作为细菌鉴定的一种靶基因，这一点已经得到专家学者的认可[1-2]。目前，gyrB基因已经广泛应用于多种细菌种属的快速鉴定，如巴氏肺炎球菌、芽孢杆菌属、苯酚分解菌和蛭弧菌属[3]。本试验参照地衣芽孢杆菌gyrB基因序列，设计1对引物，对PCR反应条件进行优化，建立地衣芽孢杆菌的PCR快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂和试剂盒

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、弗氏弧菌均由山东绿都生物科技有限公司实验室保存，马丁肉汤培养基购自北京中海生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 PCR引物设计和合成

参照Genbank登录的地衣芽孢杆菌gyrB基因序列（DQ309295），用Primer primer 5.0软件分析后，设计1对引物，gyrB-F：5'-GCCGGCTTCATGGG TTCCG-3'，gyrB-R:5'-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 PCR模板制备

将地衣芽孢杆菌接种于马丁肉汤，37℃培养18～20 h，离心沉淀菌体用磷酸盐缓冲液离心洗涤2次后，提取其基因组DNA，按照百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提供的方法进行操作，同时提取其他几种对照菌的DNA作为模板。

1.4 PCR反应体系和条件的优化

PCR反应体系：10×缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，引物上、下游各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O补至25 μL。然后对退火温度进行优化（48～58℃梯度温度，每2℃为1个梯度），最后确定反应程序为：95℃5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，从94℃开始30个循环，最后72℃延伸10 min。

1.5 PCR产物电泳检测和测序分析

取PCR产物5 μL，用琼脂糖凝胶1.2%电泳进行检测，回收目的基因，连接pMD18-T载体，转化感受态DH5α，将经PCR鉴定阳性菌落，摇菌，提取质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定，并将测出的序列与GenBank中参照的的地衣芽孢杆菌gyrB基因序列进行相似性比较。

1.6 特异性检测

分别提取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、弗氏弧菌等6种细菌的基因组DNA作为模板，用已建立的方法进行扩增。

1.7 敏感性检测

用核酸浓度测定仪测定制备的地衣芽孢杆菌基因组DNA的浓度后，10倍系列稀释DNA，使其分别相当于含有DNA 10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg，分别作为模板，做PCR扩增，检验检测方法的敏感性。

1.8 重复性检验

用建立的PCR检测方法，对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、弗氏弧菌的DNA，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 PCR产物的检测和序列鉴定

用1.2%琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR扩增产物，结果在507 bp出现一条特异性条带，见图1。

图1 地衣芽孢杆菌PCR扩增结果

将PCR产物连接pMD18-T载体后，进行测序，测得的序列如下：

将该序列与GenBank登录地衣芽孢杆菌（登录号：DQ309295）的序列进行比对分析，结果表明，两序列的相似性为100%。

2.2 特异性检测

PCR扩增结果表明，只有地衣芽孢杆菌出现了507 bp的扩增条带（预期大小为507 bp），对照菌的PCR扩增均无条带。因此，该引物对地衣芽孢杆菌具有较强的特异性，特异性试验见图2。

图2 特异性试验

2.3 敏感性检测

分别取PCR扩增产物5 μL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，由检测结果可知，该PCR方法最低可检测1 pg地衣芽孢杆菌基因组DNA的量，敏感性检测见图3。

图3 敏感性试验

2.4 重复性检验

3次重复性的试验结果均无差别，表明建立的检测方法稳定且具有良好的可重复性。

3 讨论

传统的地衣芽孢杆菌实验室检测方法（病原分离与生化鉴定等）操作复杂，耗时长，也可用多位点可变分析法、real-time PCR等进行检测[4-5]。然而这些检测方法相对普通PCR有较高的要求，需要特殊的仪器设备，不能满足基层工作者对地衣芽孢杆菌的快速检测鉴定的需求。李宏等根据地衣芽孢杆菌的gyrB基因序列设计了1对特异性引物，扩增产物大小为303 bp，以此引物对为基础，成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L－1的地衣芽孢杆菌PCR检测方法[6]。

本试验参照Genbank中登录的地衣芽孢杆菌gyrB基因，对序列进行分析，设计1对引物，对地衣芽孢杆菌PCR检测方法进行优化，分别采用48、50、52、54、56、58℃等6个不同的退火温度，得到PCR扩增反应最佳的退火温度是54℃，该法只对地衣芽孢杆菌的核酸有特异性扩增条带，对枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、弗氏弧菌的扩增结果均为阴性，该PCR检测地衣芽孢杆菌灵敏度可以达到1 pg DNA。试验结果表明，该检测方法操作简便，敏感性高，实用性强，且有较高的特异性，能快速从多种细菌中鉴定出地衣芽孢杆菌。

[1] Fukushima M,Kakinuma K,Hayashi H,et al.Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray [J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41（6）:2 605-2 615.

[2] 李献梅,王小芬,杨洪岩,等.促旋酶（gyrase）B亚单位基因gyrB在鉴别细菌近缘种中的应用[J].微生物学报,2008,48（5）: 701-706.

[3] 侯晓丽,陈智.分类及鉴别细菌的新靶标—gyrB基因[J].国外医学·流行病学传染病学分册,2005,32（2）:38-41.

[4] Dhakal R,Chauhan K,Seale R B,et al.Genotyping of dairy Bacillus licheniformis isolates by high resolution melt analysis of multiple variable number tandem repeat loci[J].Food Microbiology, 2013,34（2）:344-351.

[5] De Clerck E,Vanmol K,Jannes G,et al.Design of a 5,exonuclease-based real-time PCR assay for simultaneous detection of Bacillus licheniformis,members of the'B.cereus group'and B.fumarioli in gelatine[J].Letters in Applied Microbiology,2004,39 （1）:109-115.

[6] 李宏,吴海武,孟凡同,等.基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立[J].海南大学学报:自然科学版, 2013,31（3）:230-233.

Development of A PCR Method for Rapid Detection of Bacillus LicheniformisBased ongyrBGene

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,LI Shuguang1,2,MIAO Lizhong1,2,SHEN Zhiqiang1,2*

（1.Shandong Green Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,Shandong China;
2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,Shandong China）

In this study,based on gyrB gene sequences from Bacillus licheniformis,a pair of specific primers was designed.The size of the amplified product were 507 bp.The amplified results from Bacillus DNA were positive,but the results were negative from control strain.The sensitivity for Bacillus licheniformis was 1pg DNA.A PCR method for detection of Bacillus licheniformis was established.The method had the advantages of high-efficiency, high-sensitivity and high-specificity,and which set a good foundation for isolating Bacillus licheniformis from a complex microbial community samples．

Bacillus licheniformis;gyrB gene;PCR

S917.1

A

1001-0084（2015）03-0029-03

2015-01-23

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)

李天芝（1985-），女，山东菏泽人，硕士，助理研究员，主要从事动物传染病诊断技术研究。