超声波辅助碱法提取辣椒渣中蛋白质的工艺优化

唐鑫媛 夏延斌 文新昱 王亮亮

(湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128)

辣椒是中国一种重要的药食同源的蔬菜，同时也是主要的辛辣调味品［1］。辣椒富含辣椒碱、辣椒红素、β-胡萝卜素、蛋白质、VC等。其中辣椒红素已被美国FAO、WHO和中国国标等组织审定为无限制性使用的天然食品添加剂［2］。目前，美国一年所需辣椒红色素越1 000 t;日本每年约需辣椒红色素500 t;加拿大、澳大利亚、西欧等市场的需求量也很大。中国盛产辣椒，是世界上最大的辣椒红色素出口国［3］。然而，红辣椒在提取辣椒红素后会产生大量的废料，如辣椒渣，其产率可达到所投原料干辣椒的80%［4］。辣椒渣，又称辣椒粕，含有蛋白质、脂肪、糖类、VB1、尼克酸及多种矿物质等;蛋白质含量较高约14%～19%，并含有大量人体必需氨基酸［4］。

常用的蛋白质提取方法有水溶液提取法、有机溶液提取法、酶法、超声波辅助提取法等［5］。目前已有针对辣椒渣中黄酮、总酚、抗氧化物质等物质提取的研究［6，7］，但对辣椒渣中蛋白质提取的研究迄今尚未见诸于报道。本研究拟以辣椒渣为原料，采用碱法和超声波结合的方法，以提取时间、提取温度、料液比、碱液浓度为主要因素，以辣椒渣蛋白质提取率为指标，通过单因素和正交试验，探讨最佳辣椒蛋白的提取工艺，为辣椒渣的高值化利用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

辣椒渣:山东中椒英潮辣业发展有限公司。凯氏定氮法测定其蛋白质含量为15.67%;经氨基酸自动分析仪分析辣椒渣中蛋白质氨基酸组成，测得辣椒蛋白质为酸性蛋白质，进一步确定了采用碱液提取的可靠性［8］。

1.1.2 主要试剂

NaOH:分析纯，天津市船化学试剂科技有限公司;

硫酸、盐酸:分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司;

CuSO4、K2SO4、硼酸:分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备

中药粉碎机:FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司;

数控超声波清洗仪:KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司;

低速离心机:LD5-2A型，北京时代北利离心机有限公司;

pH计:PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司;

冷冻干燥机:FD-1B型，北京博医康实验仪器有限公司;

全自动凯氏定氮仪:VAP50S型，德国Gerhardt公司。

1.2 蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法［9］。按式(1)计算蛋白提取率:

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

辣椒渣→粉碎→过筛→碱法提取/超声辅助碱法提取→离心→上清液→酸沉→离心→沉淀→透析脱盐→冷冻干燥→辣椒粗蛋白［10］

1.3.2 最适原料粒度的确定 对原料进行粉碎，分别过20，40，60，80，100，120 目筛，称取各粒度辣椒渣 20 g，在碱液浓度0.1 mol/L，料液比为1∶25(m∶V)，提取温度40℃的条件下提取1 h，测定蛋白质提取率，选取最优原料粒度［10］。

1.3.3 辣椒渣蛋白质单一碱法提取工艺

(1)提取时间对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取温度50℃的条件下，分别考察不同处理时间(30，60，90，120，150，180，210，240 min)对辣椒蛋白质提取的影响。

(2)提取温度对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取时间120 min的条件下，分别考察不同提取温度(30，40，50，60，70 ℃)对辣椒蛋白质提取的影响。

(3)料液比对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，提取温度50℃，提取时间120 min的条件下，分别考察不同料液比(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(m∶V))对辣椒蛋白质提取的影响。

(4)碱液浓度对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在料液比1∶25(m∶V)，温度50℃，提取时间120 min的条件下，分别考察不同碱液浓度(0.06，0.08，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mol/L)对辣椒蛋白质提取的影响。

1.3.4 辣椒渣蛋白质超声碱法提取工艺

(1)超声波功率对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.1 mol/L，料液比为1∶25(m∶V)，提取温度40℃，提取时间1 h的条件下，分别考察不同超声波功率(0，100，150，200，250 W)对辣椒蛋白质提取的影响。

(2)提取时间对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，提取温度50℃的条件下，分别考察不同超声提取时间(30，60，90，120，150 min)对辣椒蛋白质提取的影响。

(3)提取温度对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)，超声提取时间120 min的条件下，分别考察不同提取温度(30，40，50，60，70 ℃)对辣椒蛋白质提取的影响。

(4)料液比对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在碱液浓度0.3 mol/L，提取温度50℃，超声提取时间120 min的条件下，分别考察不同料液比(1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(m∶V))对辣椒蛋白质提取的影响。

(5)碱液浓度对辣椒蛋白质提取的影响:称取过筛100目的辣椒渣20 g，在料液比1∶25(m∶V)，温度50℃，超声提取时间120 min的条件下，分别考察不同碱液浓度(0.06，0.08，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mol/L)对辣椒蛋白质提取的影响。

1.3.5 辣椒蛋白质提取条件的优化 以辣椒蛋白质提取率为指标，选取最适原料粒度和最适超声功率，并通过单一碱法和超声辅助碱法分别研究提取时间、提取温度、料液比和碱液浓度对辣椒蛋白质提取率的影响。选取最优的单因素条件，进行正交试验设计，确定最佳蛋白质提取工艺。

1.3.6 辣椒蛋白质等电点的测定 在正交最优提取条件下，提取辣椒蛋白质，将提取液分装于50 mL离心管，每管30 mL，用 1 mol/L HCl调节各管提取液 pH 分别为 2.8，3 .0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.2，4.4，4.6。静止 30 min，3 000 r/min离心5 min，去上清液，沉淀经干燥后称重。沉淀物最重的即为辣椒蛋白质的等电点。

2 结果与分析

2.1 原料粒度对辣椒蛋白质提取的影响

由图1可知，随着原料粒度的增大，蛋白质提取率呈现增大的趋势，从20目的39.41%到120目的46.02%，原料粒度每增大20目，蛋白质提取率平均提高1.32%。原料粒度从100目到120目，蛋白质提取率仅增加0.46%。同时原料粒度增大，蛋白质提取率提高，其他可溶性杂质也更容易被溶出，降低粗提物中蛋白质的含量，且增加后期纯化难度［11］。综合考虑，原料适宜粉碎粒度为100目。

图1 原料粒度对辣椒蛋白质提取的影响Figure 1 Effect of material size on extraction rate of pepper protein

2.2 超声功率对辣椒蛋白质提取的影响

由图2可知，采用超声波辅助碱法提取辣椒渣蛋白质后，辣椒渣蛋白质提取率显著提高，超声功率250 W时的提取率比无超声辅助提取的提取率高出31.71%。超声波功率为100，150，200，250 W时，辣椒渣蛋白质提取率由70%分别提高至72%，74%，77%，超声波功率越高，辣椒渣蛋白质提取率越大。研究表明:对于一定频率的超声波，功率增大，声强越大，空化泡崩溃的时间变短，提高了目的物的提取率［12］。综合考虑，超声波功率应选250 W。

图2 超声功率对辣椒蛋白质提取的影响Figure 2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of pepper protein

2.3 提取时间对辣椒蛋白质提取的影响

由图3可知，两种试验方法的提取率都随着提取时间的延长而提高，单一碱提法的蛋白质提取率持续稳定上升，而超声波辅助碱法在90～150 min时，提取率提高得不显著。单一碱法在提取时间240 min时，提取率达到64.12%，小于超声提取时间30 min的提取率66.19%。由此可见，超声波的辅助作用能显著缩短辣椒蛋白质的提取时间;同时超声时间150 min时，提取率达到85.73%，比相同时间的单一碱法提取率高24.5%，超声波辅助在很大程度也上提高了蛋白质的提取率。这是因为超声波振动引起细胞内物质运动，改变了细胞通透性同时单向振动引发膨胀，增多及加快了碱液向原料细胞渗透的几率和速度，从而显著减少了提取的时间，增大了提取率［13］。综合考虑，选择最佳提取时间是超声提取90 min，此时提取率为82.6%。

图3 提取时间对辣椒蛋白质提取的影响Figure 3 Effect of extracting time on extraction rate of pepper protein

2.4 提取温度对辣椒蛋白质提取的影响

由图4可知，单一碱法的提取率随着温度的上升一直显著提高，在70℃时，蛋白质提取率为82.25%，而超声辅助提取温度达到50℃时，蛋白质提取率为84.91%，随后趋于稳定。随着温度的提高，水分子的热运动加剧，与此同时蛋白质分子的立体结构伸展，这样有利于蛋白质的溶解，从而提高了提取率;但是温度过高，易导致辣椒蛋白质热变性，不利于蛋白质的加工应用［13］。综合考虑，超声辅助碱液法的最佳提取温度为50℃。

图4 提取温度对辣椒蛋白质提取的影响Figure 4 Effect of extracting time on extraction rate of pepper protein

2.5 料液比对辣椒蛋白质提取的影响

由图5可知，随着料液比的增大，两种提取方法的提取率都是先增大后降低。随着料液比的增大，体系的黏度降低，传质过程加快，因而提取率提高;但料液比过高，蛋白质提取率增加缓慢，不利于蛋白质的后期沉淀，且增加提取后废水处理的负担［14］。单一碱法和超声辅助碱法分别在料液比为1∶30和1∶25(m∶V)时，提取率达到最大。

图5 料液比对辣椒蛋白质提取的影响Figure 5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of pepper protein

2.6 碱液浓度对辣椒蛋白质提取的影响

由图6可知，随着碱液浓度的提高，辣椒渣中蛋白质的提取率不断提高。碱液浓度0.5 mol/L比0.06 mol/L时，辣椒渣蛋白质提取率高了25%;碱液浓度由0.3 mol/L升至0.5 mol/L时，蛋白质提取率增大的幅度减缓，仅提高了1.7%;单一碱法提取时，辣椒渣中蛋白质提取率即使在高碱液浓度的条件下仍然很低，为64.69%。碱法提取辣椒渣中蛋白质时，所需碱液浓度高，有研究［15，16］表明，在高碱条件下，会改变蛋白质的特性，生成赖丙氨酸等有毒物质，引起辣椒蛋白质营养物质的损失;并且采用高浓度的碱液提取时，酸法沉淀后粗蛋白质中会有大量的盐，不利于蛋白质后期的除盐纯化［17］。综合考虑，超声辅助碱法提取的碱液浓度为0.3 mol/L最好。

图6 碱液浓度对辣椒蛋白质提取的影响Figure 6 Effect of NaOH concentration on extraction rate of pepper protein

2.7 辣椒蛋白质超声碱法提取条件的正交优化

在单因素的基础上，设计以超声时间、超声温度、料液比、碱液浓度为四因素三水平的正交试验。正交试验设计见表1，试验结果见表2。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

由表2可知，各因素对辣椒蛋白提取率的影响顺序为超声温度＞超声时间＞碱液浓度＞料液比，最佳提取工艺为A3B3C2D2，即超声温度60℃，超声时间120 min，碱液浓度0.3 mol/L，料液比1∶25(m∶V)。由正交试验分析，得出的最优工艺条件与单因素分析得出的最宜提取条件有所偏差，如超声时间，考虑到超声时间越长提取率越大，从提取率考虑，超声时间120 min更好。在正交最佳工艺下测得辣椒蛋白质的提取率为86.48%。

采用正交最优工艺条件，进行重复性试验［18］。结果见表3。由表3可知，辣椒蛋白质平均提取率为86.41%;相对平均偏差为0.32%，相对标准偏差为0.39%，且都小于5%。由此表明在最佳正交条件下蛋白质提取率高，且试验重现性较好。

2.8 辣椒蛋白质等电点的测定

在正交最优条件下提取辣椒蛋白质，采用酸沉淀法和称重法测定辣椒蛋白的等点。蛋白质在某一pH的溶液中，它所带的正电荷与负电荷相等时，静电排斥作用最小，蛋白质沉淀，因此可选取沉淀最大的pH值作为蛋白质的等电点［19］。由图7 可知，在 pH 3.6 时，沉淀物最重，即 pH 3.6 为采用碱溶酸沉法提取时辣椒蛋白质的等电点。最后对辣椒粗蛋白进行纯度测定，测得蛋白质纯度为60.09%。

表3 重复性试验Table 3 Results of reduplicate tests %

图7 辣椒蛋白质溶解度与pH的关系Figure 7 Effect of pH on solubility of pepper protein

3 结论

(1)提取辣椒蛋白质，超声辅助碱法比单一碱法提取效果好，同等条件下，大幅度提高了提取率。

(2)用超声碱法提取蛋白质的最佳工艺条件是:碱液浓度 0.3 mol/L，料液比 1∶25(m∶V)，碱提温度60℃，超声提取时间120 min。此条件下辣椒蛋白质的提取率达到86.41%，粗提取物中蛋白质质量分数为60.09%，并测得辣椒蛋白质的最佳等电点为pH 3.6，为辣椒渣蛋白质的提取及应用提供了理论依据。

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