方格星虫蛋白酶解工艺优化

孙雪萍 杨家林 徐 艳 刘海娟 任 义

(1.广西海洋研究所，广西北海 536000;2.北海艺术设计职业学院环境艺术设计系，广西 北海 536000)

方格星虫(Sipunculus nudus)，俗称沙虫，属于星虫动物门，星虫科，方格星虫属动物，在中国海域有广阔的资源分布。据记载［1］，沙虫性寒、味甘、咸，具有滋阴降火、清肺补虚、活血强身及补肾养颜等功能，可以治疗骨蒸潮热，阴虚盗汗、肺虚喘咳等多种病症。近年来大量的研究［2#4］发现，天然来源的蛋白质经过酶促反应水解后，得到的小肽具有多种生理功能，如抗氧化、抗菌、降血压、降血脂及免疫调节等作用。现代研究［5#7］亦表明方格星虫含有丰富的蛋白质，多种氨基酸和微量元素，具有抗氧化、抗菌、抗辐射等多种生物活性。目前已有研究［8］表明，方格星虫经过生物酶解后获得的酶解产物含有蛋白质、多肽以及游离氨基酸等成分，并具有较强的抗氧化作用。本研究拟采用响应面分析法优化采集自北海北部湾海域的方格星虫的蛋白酶解工艺，旨在为方格星虫的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

方格星虫:采自广西北海的广西海洋研究所海水养殖示范基地的沙虫养殖大塘，干燥后粉碎，过80目筛备用，凯氏定氮法测定蛋白含量为(69.3±5.41)%;

三硝基苯磺酸(TNBS)，美国Sigma公司;

胃蛋白酶(5万U/g)、木瓜蛋白酶(9万U/g)、碱性蛋白酶(55万U/g)、复合蛋白酶(8万U/g)、风味蛋白酶(3万U/g)和中性蛋白酶(5万U/g):诺维信生物技术有限公司;

胰蛋白酶:1万U/g，广西南宁东恒华道生物科技有限公司;

其余试剂为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

电热恒温浴锅:DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司;

紫外可见分光光度计:TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司;

精密电子天平:ME104型，梅特勒—托利多仪器有限公司;

精密pH计:PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司;

氮磷钙测定仪:NPCa-02型，上海洪纪仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水解用酶的筛选 取1.5 g方格星虫蛋白粉，加入30 mL水，按照表1中7种蛋白水解酶最适宜酶解条件进行酶解，酶与底物比设定为5%，搅拌酶解4 h后，沸水灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液测定水解度。

表1 7种蛋白水解酶最适宜的反应条件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of seven proteases

1.2.2 水解度的测定 取水解上清液0.5 mL，加入 1%SDS 2.5 mL混合均匀。取混合液15 μL，依次加入1%SDS 35 μL，pH 8.2 磷酸缓冲溶液 1 000 μL，0.1% 三硝基苯磺酸(TNBS)500 μL。混匀后置于50℃烘箱中避光反应1 h后，加入0.1%HCl 2 mL终止反应，室温静置30 min后，340 nm下测定吸光值。以赖氨酸为对照品制作标准曲线。按照式(1)、(2)计算水解度(degree of hydrolysis，DH)［9］。

式中:

DH——水解度，%;

C1——水解后的游离氨基浓度，mmol/mL;

C0——水解前的游离氨基浓度，mmol/mL;

P——总肽键浓度，mmol/mL。

式中:

Ch——水解液蛋白浓度，g/mL;

htot——底物中肽键总数，由氨基酸分析结果得到方格星虫为 9.6 mmol/g。

1.2.3 单因素考察 在确定水解用酶的基础上，考察了酶与底物比(Enzyme/Substrate，E/S)，酶解时间和酶解温度3个因素对方格星虫蛋白酶解效果的影响。

(1)酶与底物比对水解度的影响:取方格星虫蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照不同的酶与底物比(4%，5%，6%，7%，8%)，50℃搅拌酶解4 h后，开水煮沸10 min灭酶，4 000 r/min离心10 min，取上清液测定水解度。

(2)酶解时间对水解度的影响:取方格星虫蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S为7%，50℃搅拌酶解不同时间(2，3，4，5，6 h)，灭酶，离心后测定水解度。

(3)酶解温度对水解度的影响:取方格星虫蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S为7%，在不同酶解温度下(40，45，50，55，60℃)搅拌酶解5 h后，灭酶，离心后测定水解度。

1.2.4 响应面分析试验设计 在单因素试验考察的基础上，确定了E/S、酶解时间和酶解温度3个因素的最适宜考察范围。采用Design Expert 8.05软件，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以E/S、酶解时间和酶解温度为自变量，以水解度为响应值，设计三因素三水平响应面分析试验。

1.2.5 统计分析 重复3次试验，结果取其平均值。采用Design Expert 8.05软件对数据进行响应面分析，包括显著性差异分析、方差分析以及最佳试验条件和最佳响应值预测。

2 结果与分析

2.1 水解用酶的筛选

由图1可知，7种蛋白水解酶对方格星虫蛋白水解效果相差较大。胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果较差。胰蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶水解效果较好。复合蛋白酶的水解效果最佳，在相同的酶解条件下，水解度达到20.95%。因此选择复合蛋白酶用于水解方格星虫蛋白。

图1 7种蛋白水解酶的水解效果Figure 1 The hydrolysis effects of seven different proteases

2.2 单因素考察

2.2.1 酶与底物比(E/S)对水解度的影响 由图2可知，在一定范围内，随着E/S的升高，水解度随之升高。但当E/S超过7%，水解度出现下降的趋势，可能是由于酶浓度逐渐为底物所饱和的原因，因此选择E/S为6% ～8%作为响应面考察的范围。

2.2.2 酶解时间对水解度的影响 由图3可知，在2～5 h时，随着酶解时间的延长，方格星虫蛋白的水解度相应地增加。当酶解时间超过5 h后，水解度有所下降。结果表明在5 h左右时蛋白基本水解达到平衡，因此选择4～6 h作为考察范围。

图2 酶与底物比对水解度的影响Figure 2 Effects of E/S on DH

图3 酶解时间对水解度的影响Figure 3 Effects of hydrolysis time on DH

2.2.3 酶解温度对水解度的影响 由图4可知，随着酶解温度的不断升高，水解度呈现先上升而后下降的变化趋势。在40～50℃时，水解度随着酶解温度的升高而升高。当酶解温度超过50℃，水解度有所下降。虽然酶解温度的升高能够提高酶解反应的速率，但是酶是一种具有催化活性的蛋白质，温度过高会导致其部分失去催化活性，从而会减低酶促反应速率，因此选择45～55℃作为考察范围。

2.3 响应面试验设计分析及结果

2.3.1 模型建立及显著性差异分析 本研究在考察单因素的基础上，采用响应面分析法对方格星虫蛋白的最优酶解工艺进行优化。试验因素及水平取值见表2。利用Design-expert软件对表3的数据进行多元回归拟合，得到对E/S、酶解时间和酶解温度的二元多次回归方程为:

图4 酶解温度对水解度的影响Figure 4 Effects of hydrolysis temperature on DH

表2 响应面分析因素及水平表Table 2 Factor and level of response surface experiment

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

由表4可知，模型二次项X1X2、X12和X32差异显著。同时由P值可知，在E/S、酶解时间和酶解温度3个因素中，酶解温度对水解度的影响最大，其次为酶解时间和E/S。同时由方差分析结果可以看出，回归模型的P值为0.015 9，表明回归模型显著。失拟项的P值为0.976 2，表明失拟误差相对于纯误差是不显著的，该模型具有较好的回归系数(R2=0.879 9)，说明该试验设计是合理稳定的，能够较好地描述试验结果，使用回归方程代替真实的试验点进行方格星虫蛋白酶解的分析和预测是可行的。

2.3.2 响应面直观分析 由图5可知，酶与底物比和酶解时间对水解度的影响不大，在两个因素的全值变化范围内，水解度随酶与底物比的增加呈现先增加后降低的趋势，随着酶解时间的不断延长，水解度趋于平稳。由图6可知，酶解温度的变化对水解度的影响高于E/S，在两个因素的全值变化范围内，水解度均呈现先增加后降低的趋势，两者的交互作用在图形中反映出适宜的条件会使水解度到达最大值，但是过高或过低都会使水解度降低。由图7可知，酶解时间和酶解温度的相互作用呈现同样的变化趋势。

表4 响应面分析方差分析表Table 4 Variance analysis of response surface design

图5 酶与底物比与酶解时间的等高线图和响应面图Figure 5 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and enzymatic hydrolysis time

图6 酶与底物比与酶解温度的等高线图和响应面图Figure 6 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and hydrolysis temperature

图7 酶解时间与酶解温度的等高线图和响应面图Figure 7 Contour diagram and response surface plot of effects of enzymatic hydrolysis time and hydrolysis temperature

综合以上单因素及响应面分析试验结果，使用Designexpert软件，得到最佳的酶解条件为:E/S7.81%，酶解时间4 h，酶解温度50.93℃，预期达到的水解度为23.76%。考虑实际生产情况，最佳酶解条件修正为酶与底物比7.8%，酶解时间4 h，酶解温度50℃。按照确定的最佳酶解条件进行酶解验证实验(n=3)，所得的实际水解度为(24.81±1.72)%，说明所建立的试验模型能够真实反映三因素对于复合蛋白酶酶解方格星虫蛋白的影响，该酶解工艺可靠稳定。

3 结论

本研究通过单因素试验和响应面分析法，考察了酶与底物比、酶解时间和酶解温度3个因素对方格星虫蛋白水解的影响，经过优化得到最佳酶解条件，采用复合蛋白酶酶解，酶与底物比为7.8%，酶解时间为4 h，酶解温度为50℃。在此条件下，水解度达到24.81%，说明该工艺稳定可靠，对实际生产具有指导意义。大量研究［10#12］表明，生物活性肽是以非活性状态存在于蛋白质中，通过适当的酶解作用，可以将潜在形式存在于蛋白质的活性肽释放出来，从而得到具有特殊生物学功能的活性肽。因此本研究可为后续方格星虫蛋白的开发和利用提供理论依据，同时方格星虫蛋白酶解产物的生物活性有待于今后进一步的研究。

1 陈细香，林秀雁，卢昌义，等.方格星虫属动物的研究进展［J］.海洋科学，2008，32(6):66～69.

2 Liu Xin，Zhang Mian-song，Zhang Chao，et al.Angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory，antihypertensive and antihyperlipidaemic activities of protein hydrolysates from Rhopilema esculentum［J］.Food Chemistry，2012，134(4):2 134～2 140.

3 Sudhakar S，Nazeer R A.Structural characterization of an Indian squid antioxidant peptide and its protective effect against cellular reactive oxygen species［J］.Journal of Functional Foods，2015，14:502 ～512.

4 Pompilio A，Scocchi M，Pomponio S，et al.Antibacterial and antibiofilm effects of cathelicidin peptides against pathogens isolated from cystic fibrosis patients［J］.Peptides，2011，32(9):1 807 ～1 814.

5 朱银玲，李思东，方富永.方格星虫多肽的酶解法制备工艺优化与抗氧化作用研究［J］.化学通报，2012，75(7):642～647.

6 张桂和，赵谋明，巫光宏.方格星虫酶解物成分分析及其抗氧化作用［J］.食品与生物技术学报，2007，26(3):80～84.

7 董兰芳，张琴，童潼，等.方格星虫多糖抗菌和抗氧化活性研究［J］.广西科学，2013，20(4):289～293.

8 朱银玲，刘华忠，李思东，等.酶解法制备方格形成多肽及其抗氧化作用研究［J］.化学研究与应用，2012，24(9):1 397～1 401.

9 Cian R E，Martínez-Augustin O，Drago S R.Bioactive properties of peptides obtained by enzymatic hydrolysis from protein byproducts of Porphyra columbina［J］.Food Research International，2012，49(1):364～372.

10 任婷婷，董秀萍，朱蓓薇，等.响应面法优化海参胶原蛋白肽的制备条件［J］.食品与机械，2010，26(3):120～123.

11 徐向英，王岸娜，林伟静，等.响应面法优化燕麦全粉中蛋白质提取工艺［J］.食品与机械，2011，27(5):96～99.

12 刘新，张绵松，孟秀梅，等.海蜇ACE抑制肽水解用酶的筛选［J］.食品工业，2012，33(3)，64～66.