新疆巴什拜羊MSTN mRNA在不同月龄发育性变化研究

姚力丹，祖玲玲，马晓燕，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

新疆巴什拜羊MSTN mRNA在不同月龄发育性变化研究

姚力丹，祖玲玲，马晓燕，依明·苏来曼，决肯·阿尼瓦什
（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

运用荧光定量PCR技术对不同月龄（0日龄或初生、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄）新疆巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因的表达量进行定量，2-ΔΔCT方法分析不同生长阶段MSTN基因表达量的差异，以期获取MSTN基因在不同月龄巴什拜羊的表达规律，同时丰富与肌肉生长相关基因的研究。结果表明：初生、3月龄新疆巴什拜羊肌肉中MSTN基因的表达量极显著低于1、2、4、5月龄（P＜0.01），1月龄的表达量又极显著高于其他各月龄（P＜0.01），2月龄显著低于5月龄（P＜0.05）；初生时新疆巴什拜羊脂肪中MSTN基因的表达量极显著低于4月龄和5月龄（P＜0.01），1月龄MSTN基因的表达量极显著高于2月龄和3月龄（P＜0.01）、极显著低于4月龄和5月龄（P＜0.01），5月龄MSTN基因的表达量极显著高于4月龄（P＜0.01）。表明巴什拜羊肌肉生长发育在初生时较快，在1月龄和2月龄生长发育较慢，3月龄生长发育最快，随后生长发育趋于平稳；脂肪的生长发育在初生后略快于1月龄，2月龄和3月龄的生长发育较快，4月龄较慢，5月龄生长发育慢于其他各月龄。

巴什拜羊；MSTN基因；表达

随着国家西部大开发进程的不断推进，新疆居民的消费水平不断提高，对肉类商品需求不断增大，加之新疆所居住的庞大少数民族群体，羊肉一直处于供应不足的状态，而绵羊肉正是商品羊肉的重要组成部分。因此更需要从分子水平找到与绵羊产肉性能相关的基因，以指导肉羊生产。

肌肉生长抑制素（MSTN）也称为生长分化因子GDF-8［1］。研究发现，该基因能控制肌肉量的增长，且呈现骨骼肌生长的负调控因子活性，因此又称为肌生成抑制素。Joulia-Ekazaa等［2］根据前人研究总结了MSTN基因抑制肌肉生长的主要调控机理，随后多位学者对其进行了研究，认为传统双臀肌品种在MSTN基因上存在移码、缺失、插入、沉默等改变，而对应其他品种在该基因上则没有出现上述变化，说明MSTN与双臀肌有明显相关性［3］。Masabanda构建了包含牛MSTN的2号染色体的细胞遗传图谱，将该基因定位于2q14-15，并将2个与肌肉生长抑制素基因相关的微卫星标记定位于牛2号染色体连锁图1.5cM处［4］。1983年，人们在陶赛特羊中也发现了双肌现象，并能遗传给后代，因其臀部肌肉显著发达于普通羊，而被称做Callipyge，国外通过DNA标记将Callipyge突变基因定位于第18号常染色体上，以非孟德尔方式遗传，被称做极性超显性。1997年，McPherron等［5］通过基因打靶技术敲除小鼠体内的MSTN基因，结果发现被敲除基因的小鼠体型远远大于野生型，每块骨骼肌的质量是野生型的2～3倍，骨骼肌纤维素比野生型高出86%，这表明肌肉质量的增加可能是由于肌细胞的增生造成。2004年，Chuelke等［6］发现一个德国婴儿MSTN基因的剪接位点突变，导致了其肌肉体积是正常婴儿的2倍。除此之外，MSTN基因不仅可以调控细胞周期，而且还可以通过抑制MyoD基因的表达调控细胞的分化，从而抑制肌肉生长［7-10］。

巴什拜羊体形呈方圆形，具有遗传性能稳定、生长发育快、适应性强、耐粗饲、羔羊早熟性强、增膘快和屠宰率高等优点。自然放牧条件下羔羊有很高的产肉性能，4 ～5月龄羔羊在胴体重、屠宰率、净肉率和骨肉比等4个方面居全国首位［11］。目前，国内外已对MSTN基因研究非常深入，但并未见到巴什拜绵羊MSTN基因的相关研究。因此，本试验率先采用荧光定量PCR技术定量研究了MSTN基因在新疆地方品种巴什拜羊不同生长期的表达量，通过2-ΔΔCT法分析巴什拜羊MSTN基因在0～5月龄不同时期的相对表达量的规律性，为研究其产肉性能的分子机制和肌肉增长规律奠定理论基础，也对控制其肌肉增长，改善其肌肉品质具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 在新疆塔城裕民县选取10只巴什拜羊0日龄（或初生）羔羊，当即屠宰其中5只羔羊，以取得0日龄羔羊脂肪和肌肉组织，剩余5只羔羊按照每月采样（共采6个月）的规律，对羔羊臀部进行活体采样，取得的脂肪和肌肉样品于冻存管中分装完毕，先在液氮液面以上平衡1min，后放入液氮液面以下保存备用。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂、反转录试剂、10×dNTP Mixture、5×RT buffer、荧光定量试剂（Ribonuclease Inhibitor、SYBER Premix Ex TaqTM）均购自TaKaRa公司；Ribonuclease Inhibitor、琼脂糖、氯仿、异丙醇、冰无水乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）购自新疆阜瑞科生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 超净工作台，Eppendorf移液器，TGL-16高速台式冷冻低温离心机，DYY-6C型电泳仪，普通Biometerya PCR仪，Gel Doc 2000型凝胶成像仪，NANODROP 2000型分光光度计，液氮罐，Lightcycler2.0 PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及反转录 按照Trizol试剂说明提取巴什拜羊各期肌肉、脂肪组织总RNA于-80℃保存；各期样品总RNA分别吸取4μL，于2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA品质，利用分光光度计测定提取的各期总RNA浓度，选出OD260/OD280比值在1.8～2.0的总RNA样品。

1.2.2 cDNA的获取 20μL反转录体系见表1。反转录程序见表2。

表1 反转录体系（总体积20μL）

表2 PCR反转录反应程序

1.2.3 引物设计及合成 MSTN和β-action基因在Gen-Bank上查询到的mRNA序列分别为：NM-001009428.1、U39357，用Primer premier5.0引物设计软件设计本试验引物，所设计的引物由上海生物工程股份有限公司负责合成，将获得的引物用灭菌超纯水溶解，后稀释为10μmol/L，-20℃保存备用。MSTN、β-action基因的引物序列见表3。

表3 MSTN和β-action基因的引物序列参数

1.2.4 不同时期MSTN基因mRNA表达的定量 分别扩增MSTN和β-actin基因，检测引物特异性。然后对组织中MSTN和β-actin基因mRNA相对定量分析。具体反应体系见表4。

表4 PCR反应体系（总体积20μL）

表5 PCR反应程序

注：65～95℃升温为0.50℃/s（Plate Read），本试验使用Light Cycler实时定量PCR仪完成。

1.2.5 数据处理与统计分析 每个样品MSTN和β-actin基因定量PCR分析所获得的CT值输入到EXCEL表上，选择特定的样品作为参照（本试验以1月龄表达量为对照），利用以下相对表达量公式计算出不同月龄中MSTN基因的相对表达量，后利用SPSS 19.0统计软件进行统计，采用独立样本检验进行差异显著性检验。结果以“平均数±标准误”表示。

相对表达量计算公式：

2 结果与分析

2.1 总RNA质量检测

本试验采用1%的琼脂糖凝胶电泳对所提取的总RNA进行检测，由图1可见清晰的RNA 3条带，位置分别为：28S、18S和5.8S，RNA质量好。使用分光光度计检测样品，OD260/OD280比值在1.7～2.0，表明RNA纯度较好，可继续进行后续试验。

图1 总RNA质量检测

2.2 巴什拜羊基因PCR扩增

根据表4条件进行PCR扩增，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测MSTN基因扩增产物的质量，结果见图2。从图2可见一条清晰的MSTN基因扩增片段接近200 bp，可以做定量分析。

图2 MSTN基因PCR扩增结果

2.3 巴什拜羊MSTN基因和β-actin基因定量PCR产物特异性分析

通过以下溶解曲线分析可知：MSTN基因和β-actin基因的PCR产物均呈单一峰，可以基本排除引物二聚体或其他因素对试验的干扰，引物有很好的特异性。

图3 MSTN和β-actin基因溶解曲线

2.4 巴什拜羊MSTN基因在肌肉中不同生长期的相对表达量

从表6可以看出，MSTN基因在所检测的巴什拜羊样本中均有表达，从表达量上可以看出以下趋势：

巴什拜羊肌肉中MSTN基因的表达量在1月龄进入峰值，之后维持较低水平，其中0日龄、3月龄的表达量极显著低于1、2、4、5月龄（P＜0.01），1月龄的表达量又极显著高于其他月龄（P＜0.01），2月龄显著低于5月龄（P＜0.05）。

巴什拜羊脂肪中MSTN基因的表达量在出生后4个月维持在较低水平，在5月龄快速达到峰值，其中1月龄极显著高于2月龄和3月龄（P＜0.01），但极显著低于4月龄和5月龄（P＜0.01），0日龄极显著低于4月龄和5月龄（P＜0.01），5月龄极显著高于4月龄（P＜0.01）。

表6 巴什拜羊MSTN基因mRNA在肌肉和脂肪中不同月龄相对表达量

3 讨论

MSTN基因是通过负调控肌肉生长，在猪、牛、狗等动物中都有研究［12-14］。关于在新疆地方品种羊的研究中，祖玲玲［15］在新疆也木勒白羊不同月龄MSTN mRNA表达量研究中表明，MSTN在肌肉中的表达量3月龄显著（P＜0.05）低于其他月龄，其余各月龄均差异不显著（P＞0.05）。MSTN基因在脂肪中的表达量初生时最低，随月龄增长，表达量升高，5月龄达到最高，后随月龄增加表达量降低。吐来力江·哈木太［16］在新疆阿勒泰羊不同月龄MSTN mRNA表达量研究中表明，MSTN基因在肌肉的表达量初生时最低，4月龄最高，4～5月龄表达量显著高于初生、3月龄及6月龄（P＜0.05）。MSTN基因在脂肪中的表达量初生时最低，6月龄最高，初生～2月龄表达量显著低于3～6月龄表达量。安外尔·热合曼［17］在吐鲁番黑羊研究中也表明，MSTN基因在吐鲁番黑羊4月龄肌肉中的表达量最高。

在本研究中，MSTN基因在肌肉中的表达量1月龄显著高于其他各月龄，在脂肪中5月龄显著高于其他各月龄，这与李达等［18］的研究结果一致。MSTN基因的表达量都有个峰值，且不会随着月龄增加而增加。本研究结果表明，在肌肉中3月龄的表达量极显著低于1、2、4、5月龄（P＜0.01），脂肪中5月龄表达量极显著高于其他各月龄，这与祖玲玲［15］的研究结果一致。表明巴什拜羊MSTN基因在3月龄肌肉生长要快于1、2、4、5月龄，而5月龄脂肪生长则慢于其他各月龄。在肌肉中初生时MSTN基因表达量极显著低于1、2、4、5月龄（P＜0.01），脂肪中5月龄的表达量高于其他各月龄，2～3月龄表达量低于4～5月龄，这与吐来力江·哈木太［16］的研究结果相同。表明巴什拜羊在初生时肌肉生长要快于1、2、4、5月龄，在5月龄脂肪生长则慢于其他各月龄。而造成其他各月龄的表达量与前人不同的原因可能是由于品种不同，且巴什拜羔羊是自由、开放式的放牧饲养条件，使得MSTN基因的表达量呈现不规律的波动，而影响MSTN表达量具体有哪些因素，还有待进一步研究。

4 结论

本研究通过对巴什拜羊MSTN mRNA不同月龄发育性变化的研究表明，巴什拜羊MSTN基因在肌肉中初生和3月龄的表达量极显著低于1、2、4、5月龄（P＜0.01），表明在初生和3月龄肌肉生长发育较快于1、2、4、5月龄，1月龄肌肉生长发育慢于其他各月龄。在脂肪中5月龄表达量较高，表明巴什拜羊5月龄脂肪生长缓慢。巴什拜羊肌肉生长发育在初生时较快，随后在1月龄、2月龄生长发育较慢，3月龄生长发育最快，随后生长发育趋于稳定；脂肪并不随肌肉生长而生长，初生后略快于1月龄，2、3月龄生长发育较快，4月龄较慢，5月龄生长发育趋于平稳。

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Developm entalChangesof MSTN m RNA in X injiang BashibaiSheep at Different Ages

Yao Lidan，Zu Lingling，Juekeno·Aniwashi，etal
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

In order to obtain the expression law of MSTN gene in themuscle and fat tissues of Bashibaisheep in differentgrowth stages，theexpression of MSTN geneofBashibaisheep attheagesof0 day，1month，2months，3months，4months，5monthswere measured and analyzed.The results showed that：the MSTN gene expression levels in themuscles at the ages of0 day，3months were very significantly lower than those at the ages of 1，2，4，5 months（P＜0.01），the level at the age of 1 month was very significantlyhigher than the levelsat theagesof theothermonths.（P＜0.01），the levelat theageof2monthswassignificantly lower than the level at the age of 5 months（P＜0.01）；the MSTN gene expression level in the fat tissues at the age of 0 day was very significantly lower than those at the agesof4，5months（P＜0.01），the levelat the age of1monthwas very significantly higher than the levelsat theagesof2，3months（P＜0.01），butvery significantly lower than thoseat the agesof4，5months（P＜0.01），the level at the age of 5 months was very significantly higher than that at the age of 4 months（P＜0.01）.It indicated that：themuscle developmentatbirth was faster，became slow at the ages of 1 and 2months，was the fastestat the ages of 3months，and became stable in the following period；the fatdevelopmentatbirth was slightly faster than thatat the age of 1month，became faster at the agesof2，3months，became slow at theageof4months，was the slowestat the ageof5months.

Bashibaisheep；MSTN gene；expression

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.002

2015-04-24

国家自然科学基金（31260530）

姚力丹（1990-），女，硕士研究生。

决肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈萨克族，教授，博士，从事动物遗传育种与繁殖研究。