杜泊羊两种冲胚方法胚胎移植效果的比较

王赛赛，韩帅兵，陈其新，石 岗，李书举，宁洋洋（河南农业大学牧医工程学院，郑州450002）

杜泊羊两种冲胚方法胚胎移植效果的比较

王赛赛，韩帅兵，陈其新，石 岗，李书举，宁洋洋
（河南农业大学牧医工程学院，郑州450002）

为筛选适宜中原地区肉用绵羊快速扩繁的方法，采用输卵管冲胚法和子宫角冲胚法分别处理87只杜泊羊和43只杜泊羊，统计两种冲胚方法的只均获得胚胎数、只均获得可用胚胎数、移植妊娠率及术后粘连率等指标，分析两种胚胎移植效果的差异。结果表明：输卵管冲胚法获得的只均胚胎数、只均获得可用胚胎数均略高于子宫角冲胚法,但二者差异不显著（P＞0.05）。子宫角冲胚法术后发生粘连率较输卵管冲胚法术后发生粘连率低6.47个百分点，但同样差异不显著（P＜0.05）。因此，子宫角冲胚法胚胎移植后粘连率相对较低，是中原地区杜泊羊快速扩繁比较适宜的方法。

杜泊羊；输卵管冲胚；子宫角冲胚；胚胎移植；粘连率

杜泊羊是南非用有角陶赛特羊与波斯黑头羊杂交育成的肉用绵羊品种。它能适应各种气候，具有早期生长发育快、胴体瘦肉率高、肉质细嫩、耐热、耐粗饲、可常年发情配种等特点，杜泊羊因肉质细嫩可口，被国际市场誉为“钻石级”绵羊肉，已被世界各国广泛引种［1］。近年来，中原农区各地相继引入杜泊羊，开展地方品种杂交改良，成为最受欢迎的终端父本。但目前种羊市场价格居高不下，严重制约了肉羊业的发展。为此，河南中鹤牧业有限公司从澳大利亚引进2 000只优质杜泊种羊，期望通过种羊扩繁，为市场提供优质廉价的种羊。

胚胎移植（MOET）技术是最重要的现代动物繁殖生物技术之一，可挖掘优秀种母羊的繁殖潜力、实现种羊的快速扩繁。国内外肉羊胚胎移植操作中常用的操作方法包括输卵管冲胚法和子宫角冲胚法［2］，二者各有优、缺点。目前，肉羊MOET技术尚未在中原地区实现大规模商业化应用，相关技术仍需进一步完善。为此，作者等在内蒙古大学王建国研究员及澳大利亚专家指导下，开展胚胎移植等现代繁殖生物技术的研究应用，对常用的两种肉羊胚胎移植技术效果进行了对比分析，旨在探索杜泊羊胚胎移植的适宜操作方法，提高优秀种羊的繁殖效率，完善杜泊羊胚胎移植技术体系，促进中原肉羊业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 供受体羊的选择和管理

以优质纯种杜泊绵羊为供体，湖羊为受体。在胚胎移植处理开始前，对供、受体母羊均用B超进行检测，15 d后重复检测1次。将挑选出来的适宜母羊单独饲养，加强饲养管理并杜绝和公羊的任何接触。杜泊种公羊不参加日常配种工作，补充精料并每天饲喂2枚鸡蛋。

1.2 试验器械

腹腔内窥镜，子宫钳，剪刀，止血钳，冲胚管，培养皿，手术刀片，医用缝合线，注射器，胚胎移植手术架，留置针，消毒卫生纸，医用喷壶，镊子，体视显微镜，移植针，记号笔，等等。

1.3 试验药品

孕激素海绵栓，新西兰哈密尔顿生物公司；CIDR，新西兰哈密尔顿生物公司；垂体促卵泡素（FSH），100 IU/支，宁波市激素制品有限公司；氯前列烯醇（PG），0.2mg/支，上海市计划生育研究所；促黄体素（LH），100 IU/支，宁波市激素制品有限公司；孕马血清（PMSG），宁波市激素制品有限公司；冲胚液，1 000mL/袋，BIONICHE ANIMAL HEALTH USA。其它药品包括陆眠宁、陆醒宁、碘伏、酒精、土霉素等。

1.4 供、受体羊的管理

在胚胎移植开始前1个月，对供体（杜泊羊）、受体（湖羊）进行补饲。供体羊日均采食量1.5 kg（干物质），受体羊日均采食量1.2 kg（干物质）。日粮配方组成：玉米青贮2.0 kg，羊草1.0 kg，精料0.6 kg，胡萝卜0.5 kg。日粮配方营养成分：粗蛋白206.86 g，粗脂肪69.25 g，粗纤维459.86g，钙11.17g，磷7.00g，食盐3.00g，消化能20.29MJ。

1.5 受体同期发情处理

采用海绵栓+PMSG+PG法。即受体与同一批供体同步埋植海绵栓13 d，将埋植当天记为0 d，于海绵栓埋植的第12天下午肌肉注射PG 0.1mg，在撤栓（第13天）的同时每只羊肌肉注射PMSG 250 IU。

表1 供体羊超数排卵及撤栓方案

1.6 供体羊的超数排卵处理

采用CIDR+FSH+PG法。即在供体羊阴道内放入CIDR，埋植当天记为0 d，从埋植的第11天下午开始肌肉注射FSH，以递减剂量的方法注射3 d，共6次，每次间隔12h，在第5次注射FSH的同时肌肉注射PG 0.1mg/只并撤栓。在撤栓后12 h进行FSH的第6次处理。

1.7 配种方式

超排供体羊发情后用公羊试情，在撤栓后36 h集中采用腹腔镜技术进行子宫角输精。

1.8 胚胎的采集

采用两种方法进行胚胎采集。第1种方法是子宫角采集胚胎，即在超排羊配种后的第6天（供体羊配种后2～3d）采卵。将冲卵管一端由输卵管伞部的喇叭口插入2～3 cm深，另一端接集卵皿。用注射器吸取37℃的冲卵液5～10mL，在子宫角靠近输卵管的部位，将针头朝输卵管方向扎入。1人操作，用一只手的手指在针头方向后捏紧子宫角，防止冲卵液流入子宫，另一只手推注射器，冲卵液由宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。第2种方法是输卵管采集胚胎，即在超排羊配种后的第2天，用常规手术法将供体羊麻醉，腹部切口。用子宫钳轻轻缓慢地将子宫角牵引到腹腔外，在一侧子宫角基部用钝钳刺透子宫壁，插入冲卵导管，向冲卵管气囊打气3～5mL。在宫管结合部插入套管针，抽出针芯，并由此向子宫腔内注入冲卵液。注入冲卵液的方法：先注入冲卵液20～25mL，再注入空气5～10mL，以保证胚胎的有效回收。用培养皿接收回流冲卵液，最后用手指轻轻压挤子宫角，让冲卵液回收完全，然后气囊放气，子宫角基部缝合。供体羊在手术前肌注陆眠宁0.5mL/只、手术结束后肌注陆醒宁1mL/只，同时肌注抗生素，防止继发感染。

1.9 胚胎的检查与鉴定

胚胎采出后，在20～40倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度与透明带的间隙以及变性情况。按照形态鉴定法对胚胎进行分级，并做好详细记录。

1.10 胚胎移植

选择与供体发情时间相差1 d以内的羊进行移植。用子宫角冲胚法冲胚的将胚胎移植到子宫角，采用输卵管冲胚的将胚胎移植到输卵管的相应部位。采用边冲胚边移植的方法，避免胚胎在体外长时间的存放。手术移植时，牵引出卵巢或用腹腔镜观察卵巢上黄体的发育情况，将胚胎移植到有黄体的输卵管中部或子宫角前1/3处。

1.11 统计分析

记录同期发情处理后不同品种、不同时间段的发情母羊数，采用SPSS 22.0软件进行分层卡方检验，即以品种为行因子，以发情状况作为列因子，以时间段作为分层因子。对两种方法超排效果分析，数据以平均数±标准差表示，进行独立样本t检验。对超排、移植相关百分率数据均采用卡方检验。

2 结果与分析

2.1 供受体同期发情效果

由表2可见，在撤栓后48 h内，供、受体母羊的总体同期发情率没有显著差异（P＞0.05），但杜泊羊和湖羊撤栓后表现的发情规律不同：杜泊羊发情早，在撤栓后12～24 h内出现发情高峰期，36 h内全部高发情；湖羊发情较迟，发情高峰期出现在24～36 h内。两个品种母羊相应时间段的发情率间均存在极显著差异（P＜0.01）。

表2 供、受体羊同期发情率的比较%

2.2 供体羊的超排效果

由表3可见，在输卵管冲胚胎法组中，87只杜泊羊中77只供体采到胚胎，采胚成功率88.51%，共获胚胎394枚，其中可用胚胎376枚，可用胚胎率95.43%。在子宫角冲胚胎法组中，43只杜泊羊中39只供体采到胚胎，采胚成功率90.70%，共获胚胎180枚，其中可用胚胎174枚，可用胚胎率96.67%。两种冲胚法采胚成功率、可用胚胎 率、只均获胚胎数及只均可用胚胎数均无差异（P＞0.05）。

表3 不同冲胚方法对杜泊羊冲胚效果的影响

2.3 胚胎移植妊娠结果

将两种方法冲出的部分胚胎进行移植，受体母羊受胎结果见表4。由表4可见，两种冲胚方法冲出的胚胎经移植后的受胎率无显著差异（P＞0.05）。

表4 胚胎移植到受体后的妊娠情况

2.4 两种冲胚方法术后粘连情况

胚胎移植结束后，对处理的供体羊随机挑选出部分羊，用腹腔镜观察术后粘连情况，结果见表5。结果显示，子宫角法胚胎移植后的粘连率有降低趋势，但与输卵管法粘连率间差异不显著（P＞0.05）。

表5 两种冲胚方法术后粘连情况

3 讨论

研究表明，供体、受体母羊的发情同步差对受胎率有显著影响［3］。若供、受体同期发情的同步差在12 h以内，胚胎移植技术效率高。本试验中的供体是经过严格挑选的健康状况良好、膘情合适、能够自然发情，且至少自然生产过1胎的羊，所以同期发情效果总体比较理想，杜泊母羊在撤栓后36 h全部发情。受体湖羊在撤栓后48 h发情率达92.26%，但发情高峰期较杜泊羊迟12 h左右。这种发情时间的差异，可能对胚胎移植总体效率产生一定影响。

应用相同的超数排卵方案，对杜泊羊进行相同的处理，两种冲胚法的胚胎回收率、获得的可用胚胎率等指标均差异不显著（P＞0.05）。一般认为，输卵管法可冲出更多的胚胎，体现更好的超排效果。但由于胚胎发育阶段较早，输卵管法所获部分胚胎发育不良，胚胎的可利用率和移植后的受胎率并不高。相对而言，子宫角冲胚法获得的头均胚胎数一般低于输卵管法，但冲出的胚胎大多是桑椹胚或囊胚，发育阶段靠后，对外界环境有更大的抵抗力，所以胚胎的可利用率和移植后的受胎率较高。本试验在同一饲养环境中进行两种方法移植效果比较，证实了上述观点［4-8］。应用两种冲胚法进行胚胎移植比较试验，虽然各技术指标均未发现显著差异，但输卵管冲胚法所获胚胎数、术后粘连率比子宫角冲胚法有升高趋势。综合分析来看，在中原地区进行杜泊羊胚胎移植，以子宫角冲胚法较好。

［1］ 徐小波，王公金，储国良，等.杜泊羊冷冻胚胎移植的影响因素［J］.江苏农业学报，2007，23（6）：598-601.

［2］ CN-NY.绵羊胚胎移植技术规程［S］.2004.

［3］ 杨昇，冯建忠，张金龙，等.影响羊胚胎移植妊娠率的因素分析［J］.中国畜牧杂志，2005（7）：41-43.

［4］ 侯引绪.绒山羊植入波尔山羊胚胎分娩及助产结果分析［J］.黑龙江畜牧兽医，1998（10）：13-14.

［5］ 刘忠琛，尹怀磊，刘洪江.羊胚胎移植的实用操作技术［J］.当代畜禽养殖业，2009（3）：9-12.

［6］ 孙尚信，黄玉琴.环境因素对羊胚胎移植妊娠率的影响［J］.中国畜牧兽医，2008（5）：149-152.

［7］ 王玉琴，赵有璋.绵羊胚胎移植关键技术［J］.中国草食动物，2004，24（增刊）：82-84.

［8］ 孙尚信.羊胚胎移植术后并发症的预防与处理［J］.中国畜牧兽医，2009（5）：178-179.

S826.3

A

2095-3887（2015）04-0024-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.007

2015-05-28

王赛赛（1987-），男，硕士研究生。

陈其新（1965-），男，副教授，博士。研究方向：肉羊分子遗传与现代生物技术繁育。