Eupatilin对黄嘌呤氧化酶活性抑制的实验研究



Eupatilin对黄嘌呤氧化酶活性抑制的实验研究

王海东1谢建祥2林伟青1#

（1江西省人民医院南昌330006；2江西省儿童医院南昌330006）

摘要：目的：通过体外酶学试验分析Eupatilin对黄嘌呤氧化酶活性的影响及抑制机理。方法：利用紫外分光光度计观测尿酸生成导致的吸光度变化值，测定波长为292 nm，并以黄嘌呤为底物根据测定结果绘制Lineweaver-Burk和Dixon图。结果：Eupatilin对黄嘌呤氧化酶表现很强的抑制作用，其Ki值为0.128 6 μg/ml，抑制类型为混合型；而别嘌呤醇作为对照，其Ki值为0.62 μg/ml，抑制类型为竞争性抑制。结论：Eupatilin具有明显的黄嘌呤氧化酶抑制活性。

关键词：异泽兰黄素；黄嘌呤氧化酶；黄嘌呤；活性抑制

随着国民经济发展，人们饮食结构的变化及人口老龄化，近年来我国痛风发病率呈明显上升的趋势。现代医学研究发现痛风的根本病因是嘌呤代谢紊乱，血（尿）中嘌呤代谢最终产物即血尿酸水平持续增高。临床治疗痛风多使用秋水仙碱、非甾体类抗炎药、皮质类固醇、黄嘌呤氧化酶及黄嘌呤脱氢酶抑制剂等，虽然能控制症状，在一定程度上延缓病情，但由于对体内病理性产物缺乏清除或转化，而且还有药物的不良反应，所以难以达到理想的治疗效果。别嘌呤醇是临床上最常应用的黄嘌呤氧化酶及黄嘌呤脱氢酶抑制剂，但在临床使用中发现别嘌呤醇可能导致肝炎、超敏变态反应等较为严重的不良反应，导致患者因害怕而依从性差，因此研究出更安全可靠的方法，发挥中医药的优势，是我们面临的一个难题。Eupatilin（异泽兰黄素）是从一种复方制剂中提取出的药物DA-9601的主要活性成分，在韩国已应用于护肝、抗氧化、抗炎及抗菌。本研究通过预实验发现Eupatilin对黄嘌呤氧化酶有很强的抑制作用，并以此为基础进行了更为详细的体外酶学试验，研究分析其对黄嘌呤氧化酶活性的影响。现报告如下：

1　实验材料

1.1仪器紫外分光光度计（岛津UV1800型）、R-201旋转蒸发器（东京理化）、电子天平、876A-2型数显真空干燥箱。

1.2试剂Eupatilin（上海纯优生物科技有限公司），黄嘌呤氧化酶（sigma公司），黄嘌呤（sigma公司），别嘌呤醇（sigma公司），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸氢二钠（分析纯）。

2　实验方法

2.1溶液配制

2.1.1磷酸盐缓冲液（PBS）配制精密称取Na2HPO414.20 g和KH2PO42.72 g，加入蒸馏水配成浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液500 ml，将pH值调至7.5。

2.1.2别嘌呤醇（A）液配制精密称取别嘌呤醇2 mg，用PBS（pH=7.5）100 ml溶解，配制成浓度为20 μg/ml的别嘌呤醇溶液备用。

2.1.3黄嘌呤（X）液配制精密称取氢氧化钠0.06 g，用8 ml蒸馏水溶解，得到氢氧化钠溶液，再加入精密称取的黄嘌呤0.057 g，即为黄嘌呤氢氧化钠溶解液（a液）。精密称取磷酸二氢钾0.27 g，用10 ml蒸馏水溶解，获得磷酸二氢钾液（b液）。将a液、b液混合后，加蒸馏水稀释至40 ml，再用PBS（pH=7.5）稀释至100 ml。精密量取8 ml，加入PBS液（pH=7. 5）稀释至66.667 ml，即得到1 mmol/L的X液。

2.1.4黄嘌呤氧化酶（XO）液配制精密量取黄嘌呤氧化酶40 μl（1 U），加PBS（pH=7.5）稀释至2 ml，即得0.5 U/ml的XO液。

2.1.5 Eupatilin（异泽兰黄素）液配制精密称取1 mg Eupatilin加入50 μl二甲亚矾（DMSO）溶解后（DMSO最终浓度＜1%），再用PBS（pH= 7.5）配制成0.4 mg/ml的Eupatilin溶液备用。

2.2黄嘌呤氧化酶抑制实验

2.2.1光密度值每分钟变化A值测定取0.2 mol/L磷酸盐缓冲液400 μl，分别加入浓度为1 mmol/L的X液60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，振荡2 min后再加入200 μl即0.1 U的黄嘌呤氧化酶溶液（已预温至25℃）涡旋混匀后，用紫外分光光度计观测292 nm处该反应体系在不同时间点的吸光度值，连续测定15 min，每分钟测定1次，以时间与吸光度进行线形回归，计算斜率Rate值（dA/min）。每个样品重复操作3次，取其平均值。

2.2.2光密度值每分钟变化B值测定在60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl浓度为1 mmol/L的X液的各试管中加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液300 μl后再分别加入Eupatilin液各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl；阳性对照加入别嘌呤醇液各12.5μl、25 μl、50 μl、100 μl；空白对照则加入DMSO各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl，然后在每个试管中加入200 μl的XO液，各试管的总体积为1 ml。

2.2.3黄嘌呤氧化酶活性的计算以公式（1－B/A）×100%，计算黄嘌呤氧化酶活性抑制百分率。

2.2.4 Ki值计算用Dixon绘图法计算Ki值，以样品浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量，在两种不同浓度的底物下，获得两条直线，采用SPSS17.0统计软件包计算回归方程，求出两直线交点的X轴值，即得抑制动力学参数Ki值。

3　实验结果

3.1 Eupatilin对黄嘌呤氧化酶的抑制作用Eupatilin显著抑制了尿酸的生成，明显抑制了黄嘌呤氧化酶，表现为混合型抑制，并与浓度相关，与空白组对照差异性显著，P＜0.01。见图1。

图1　Eupatilin对黄嘌呤氧化酶的Linweaver-Burk曲线

3.2各样品对XO的抑制效果将各样品浓度与平均抑制率进行线形回归，然后根据回归方程计算抑制率I=50%时C的值，即为半数抑制浓度IC50。见表1。

表1　各样品对XO的抑制效果

3.3抑制动力学参数Ki值计算采用Dixon绘图法计算Ki值：以样品浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量，在两种不同浓度的底物下，得到两直线，再用SPSS17.0统计软件包计算回归方程，求出两直线交点的X轴值，即为抑制动力学参数Ki。见图2~图3。

图2　黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系中Eupatilin的Dixon图

图3　黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系中别嘌呤醇的Dixon图

4　讨论

本实验研究发现，Eupatilin能有效抑制黄嘌呤氧化酶活性，且与浓度相关，表现为混合型抑制，为进一步动物实验及临床研究打下了基础。Eupatilin是中药艾叶里提取的一种重要的黄酮类活性成分，具有治疗胃溃疡和镇痉的作用[1~2]，在韩国已作为抗胃溃疡药上市，另外还具有调控血糖含量[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、抗肿瘤[6~7]等功能。

近年来国内外许多学者研究报道，一些植物化学成分对黄嘌呤氧化酶具有很强的抑制作用，Flemmig等[8]研究发现一种黄酮类化合物（flavone aglycone apigenin）和木犀草素（luteolin）等对黄嘌呤氧化酶的抑制作用明显强于别嘌呤醇（其Ki值远低于别嘌呤醇）；Arimboor等[9]发现一种提取自印度植物种子中的黄酮类化合物（Tetrahydroamentoflavone）在黄嘌呤氧化酶抑制实验中也有着较强的黄嘌呤氧化酶抑制作用，其IC50值为92 nM，Ki值为0.982 μM，与别嘌呤醇差距不大（别嘌呤醇IC50值为100nM，Ki值为0.612 μM）；Lin等[10]报道一种二萜类化合物（sugiol）对黄嘌呤氧化酶也有明显的抑制作用，其IC50值为（6.8±0.4）μM。下一步我们将在此基础之上，进一步尝试通过动物实验及临床研究探索其对黄嘌呤氧化酶抑制作用、药代动力学以及药物安全性，希望能找到更安全有效的痛风治疗制剂。

参考文献

[1]Seo HJ,Surh YJ.Eupatilin, a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants, induces apoptosis in human promyelocytic leukemia cells[J].Mutat Res,2001,496(1-2):191-198

[2]Kim SH,Lee SD,Kim WB,et al.Determination of a new antiulcer agent, eupatilin, in rat plasma, bile, urine, and liver homogenate by high-performance liquid chromatography [J].Res Commun Mol Pathol Pharmacol,1997,97(2):165-170

[3]Kang YJ,Jung UJ,Lee MK,et al.Eupatilin, isolated from Artemisia princeps Pampanini, enhances hepatic glucose metabolism and pancreatic beta-cell function in type2 diabetic mice [J].Diabetes Res Clin Pract,2008,82(1):25-32

[4]Choi EJ,Oh HM,Na BR,et al.Eupatilin protects gastric epithelial cells from oxidative damage and down-regulates genes responsible for the cellular oxidative stress[J].Pharm Res,2008,25(6):1355-1364

[5]Joo M,Kim HS,Kwon TH,et al.Anti-inflammatory Effects of Flavonoids on TNBS-induced Colitis of Rats [J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(1):43-50

[6]Park BB,Yoon JS,Kim ES,et al.Inhibitory effects of eupatilin on tumor invasion of human gastric cancer MKN-1 cells [J].Tumour Biol,2013,34(2):875-885

[7]Koshihara Y,Neichi T,Murota S,et a1.Selective inhibition of 5-lipoxygenase by natural compounds isolated from Chinese plants, Artemisia rubripes Nakai[J].FEBS Lett,l983,158(1):41-44

[8]Flemmig J,Kuchta K,Arnhold J,et al.Olea europaea leaf (Ph.Eur.) extract as well as several of its isolated phenolics inhibit the gout-related enzyme xanthine oxidase[J].Phytomedicine,2011,18(7): 561-566

[9]Arimboor R,Rangan M,Aravind SG,et al.Tetrahydroamentoflavone (THA) from Semecarpus anacardium as a potent inhibitor of xanthine oxidase[J].J Ethnopharmacol,2011,133(3):1117-1120

[10]Lin CN,Huang AM,Lin KW,et al.Xanthine oxidase inhibitory terpenoids of Amentotaxus formosana protect cisplatin-induced cell death by reducing reactive oxygen species (ROS) in normal human urothelial and bladder cancer cells [J].Phytochemistry,2010,71 (17-18):2140-2146

Study on Inhibitory Effect of Eupatilin on Xanthine Oxidase Activity

WANG Hai-dong1, XIE Jian-xiang2, LIN Wei-qing1#(1The People’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006; 2The Children’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006)

Abstract:Objective: To research the influence and inhibitory mechanism of Eupatilin on the activity of Xanthine Oxidase by vitro enzymatic test. Methods: Determined the absorbance changes caused by the formation of uric acid value by using UV spectrophotometer, the detection wavelength was 292 nm, according to the measured results, draw the Lineweaver Burk and Dixon plots with Xanthine as substrate. Results: Eupatilin had strong inhibition on Xanthine Oxidase, the Ki value was 0.128 6 μg/ml, the type of inhibition is of mixed type; and with Allopurinol as a reference, the Ki value was 0.62 μg/ml, the type of inhibition was competitive inhibition. Conclusion: Eupatilin has the obvious inhibitory activity of Xanthine Oxidase.

Key words:Eupatilin; Xanthine oxidase (XO); Xanthine; Inhibitory effect

收稿日期：（2015-03-23）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.054

文献标识码：B

中图分类号：R285.5