Apigenin对黄嘌呤氧化酶活性抑制的实验研究

林伟青 谢建祥 王雅娟 王海东#

（1江西省人民医院 南昌330006；2江西省儿童医院 南昌330006；3江西省丰城市石滩中心医院 丰城331100）

随着我国经济发展及人口老龄化，痛风发病率有明显增高趋势。现代医学认为痛风的基本病因是嘌呤代谢紊乱，血（尿）中嘌呤代谢最终产物-血尿酸持续增高。治疗痛风多采用秋水仙碱、非甾体类抗炎药、黄嘌呤氧化酶及黄嘌呤脱氢酶抑制剂等西药治疗，这些药物能在一定程度上控制症状、稳定病情，但由于药物的不良反应，及对体内病理性产物缺乏进行清除转化的综合治疗方法，难以达到理想的结果。别嘌呤醇是我们在临床上最常使用的黄嘌呤氧化酶及黄嘌呤脱氢酶抑制剂，但是，由于别嘌呤醇可能导致较为严重的不良反应，如肝炎、超敏变态反应等，导致患者因害怕不良反应而依从性较差，因此探寻更安全有效的制剂，充分发挥中医药的优势，是我们面临的一项课题。

Apigenin（芹菜素）即 4，5，7-三羟基黄酮，在各种蔬菜、水果以及中草药中广泛存在，具有抗病毒、抗菌、降压、预防动脉粥样硬化、抑制肿瘤细胞生长等多种生理活性，并且具有无变异、安全无毒的特性。有报道称其具有抑制和治疗多种肿瘤的潜能，在各种肿瘤治疗的研究中广泛使用，而对其它疾病的治疗方面少有研究。本课题通过预实验发现Apigenin对黄嘌呤氧化酶有较强的抑制作用，并以此为基础进行更为详细的体外酶学试验，从而研究其对黄嘌呤氧化酶活性的影响。现报告如下：

1 实验材料

1.1 仪器 R-201旋转蒸发器（东京理化）、紫外分光光度计（岛津UV1800型）、电子天平、876A-2型数显真空干燥箱。

1.2 试剂 Apigenin（上海纯优生物科技有限公司），黄嘌呤氧化酶（sigma公司），黄嘌呤（sigma公司），别嘌呤醇（sigma公司），磷酸二氢钾（分析纯）磷酸氢二钠（分析纯）。

2 实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 磷酸盐缓冲液 （PBS）的配制 精密称取KH2PO42.72 g和Na2HPO414.20 g，加蒸馏水50 ml，配成0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值调至7.5 。

2.1.2 别嘌呤醇（A）液配制 精密称取别嘌呤醇mg，用 PBS（pH=7.5）100 ml溶解，配制成浓度为 2 μg/ml的别嘌呤醇液。

2.1.3 黄嘌呤（X）液配制 精密称取氢氧化钠0.0 g，用8 ml蒸馏水溶解，得氢氧化钠溶液，再加入精密称取的黄嘌呤0.057 g，得到黄嘌呤氢氧化钠溶解液（a液）。精密称取磷酸二氢钾0.27 g，用10 ml蒸馏水溶解，得到磷酸二氢钾液（b液）。将a液、b液混合后加蒸馏水稀释至40 ml，再用PBS（pH=7.5）稀释至 100 ml。精密量取 8 ml，再用 PBS（pH=7.5）稀释至66.667 ml，即得1 mmol/L的X液。

2.1.4 黄嘌呤氧化酶（XO）液配制 精密量取黄嘌呤氧化酶40 μl（1 U），用PBS（pH=7.5）稀释至2 ml，即得0.5 U/ml的XO液。

2.1.5 Apigenin液配制 用二甲亚矾（DMSO）50 μl溶解1 mg Apigenin后，加磷酸盐缓冲液（pH=7.5）配制成0.4 mg/ml的Apigenin溶液（DMSO最终浓度＜1%）。

2.2 黄嘌呤氧化酶抑制实验

2.2.1 吸光度值每分钟变化值A值的测定 取400 μl 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液分别加入浓度为1 mmol/L 的 X 液 60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，振荡2 min后加入0.1 U即200 μl黄嘌呤氧化酶液（已预温至25℃）涡旋混匀后，用紫外分光光度计测量292 nm处该反应体系在不同时间点的吸光度值，连续测定15 min，每分钟测定1次，测定吸光度值每分钟变化值（A）。

2.2.2 吸光度值每分钟变化值B值的测定 在60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl浓度为 1 mmol/L的X液的各试管中加入浓度为0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液 300 μl，再分别加入 Apigenin 液各 12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl，阳性对照加入别嘌呤醇液各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl； 空 白 对 照 则 加 入DMSO 各 12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl；然后，在每个试管中加入浓度为0.5 U/ml的XO液200 μl，各试管的溶液总体积为1 ml。

2.2.3 黄嘌呤氧化酶 （XO）活性的计算 以公式（1－B/A）×100%，计算各样本对XO的活性抑制百分率。

2.2.4 抑制动力学参数Ki值计算 用Dixon绘图法计算Ki值，以样品浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量，在两种不同浓度的底物下，得到两条直线，采用SPSS17.0统计软件包计算回归方程，求出两直线的交点的X轴值，即可得到抑制动力学参数Ki值。

3 实验结果

3.1 Apigenin对黄嘌呤氧化酶的抑制作用Apigenin显著抑制了尿酸的生成，并与浓度相关，是黄嘌呤氧化酶的混合型抑制剂，与空白组对照差异性显著，P＜0.01。见图1。

图1 Apigenin对黄嘌呤氧化酶的Linweaver-Burk曲线

3.2 各样品对XO的抑制效果 将各样品浓度与平均抑制率进行线形回归，然后根据回归方程计算抑制率I=50%时C的值，即为半数抑制浓度IC50。见表1。

表1 各样品对XO的抑制效果

3.3 Ki值计算 用Dixon绘图法计算Ki值：以样品浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量，在两种不同浓度的底物下，得到两直线，再用SPSS17.0统计软件包计算回归方程，计算出两直线的交点的X轴值，可得到抑制动力学参数Ki。见图2～3。

图2 黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系中Apigenin的Dixon图

图3 黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系中别嘌呤醇的Dixon图

4 讨论

本实验研究发现，Apigenin能有效抑制黄嘌呤氧化酶活性，并且与浓度相关，为进一步进行动物实验及临床研究打下了基础。Apigenin是一种广泛存在的黄酮类化合物，在各种植物蔬菜、水果、豆类中含量丰富，尤其在芹菜中含量最高。研究发现其具有抗炎症[1]、降低血压[2]、抗焦虑[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]以及抗肿瘤[7～8]等作用。

近年来国内外许多学者研究报道，一些植物化学成分对黄嘌呤氧化酶具有很强的抑制作用，Flemmig等[9]研究发现一种黄酮类化合物（flavone aglycone apigenin）和木犀草素（luteolin）等对黄嘌呤氧化酶的抑制作用明显强于别嘌呤醇（其Ki值远低于别嘌呤醇）；Arimboor等[10]发现一种提取自印度植物种子中的黄酮类化合物（Tetrahydroamentoflavone）在黄嘌呤氧化酶抑制实验中也有着较强的黄嘌呤氧化酶抑制作用，其IC50值为92 nM，Ki值为0.982 μM，与别嘌呤醇差距不大（别嘌呤醇IC50值为100 nM，Ki值为 0.612 μM）；Lin 等[11]报道有一种二萜类化合物（sugiol）对黄嘌呤氧化酶也有明显的抑制作用，其IC50值为（6.8±0.4）μM。下一步我们将在此基础上，尝试通过动物实验及临床研究进一步研究其黄嘌呤氧化酶抑制作用、药代动力学以及安全性，以期能找到更安全有效的痛风治疗方法。

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