硅藻土提取尿中士的宁和马钱子碱LC-MS/MS测定法



硅藻土提取尿中士的宁和马钱子碱LC-MS/MS测定法

吴玉红1，宋鹏2，邵博3

（1.重庆警察学院刑事科学技术系，重庆401331；2.上海市国内安全保卫局，上海200042；3.黑龙江省公安厅刑事技术总队，黑龙江哈尔滨150008）

【摘要】用硅藻土提取尿中士的宁和马钱子碱，然后采用LC-MS/MS测定的方法检测。士的宁和马钱子碱检出限分别为1.5ng/ mL和1.2ng/ mL；提取率分别为98.4%，96.8%；线性范围0.01～10 g/mL。可作为法医毒物常规检验。

【关键词】马钱子碱；士的宁；尿；硅藻土；LC-MS/MS

士的宁和马钱子碱共存于马钱属的许多植物中，是一种常见的生物碱。士的宁是一种中枢神经兴奋剂，医疗中常用于治疗弱视症、瘫痪及再生障碍性贫尿。马钱子碱常用于治疗中风引起的神经麻痹和作为键胃药。常见使用不当或服药过量引起的中毒或死亡。

目前，对生物检材中士的宁和马钱子碱的检验方法，有紫外导数光谱法[1]、气相色谱法、气相色谱－质谱联用法[2]和高效液相色谱法[3]，以气相色谱－气质联用法最为常见。由于两种生物碱分子量相对较大，不易汽化，应用气相色谱和气相色谱－气质联用法需采用较高的柱温，否则，灵敏度低，易造成柱温流失。采用高效液相色谱法又易拖尾。为此，采用硅藻土提取方法和高效液相色谱－二级质谱联用检测技术，方法简单快速、提取率高、灵敏度高。

一、实验部分

（一）仪器、材料及试剂

LXQ液相色谱－质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）。

人尿：取自近期未服药物，健康人排泄的尿液。

士的宁、马钱子碱：分析纯，质量符合国家药典规定；用甲醇配制成1.0mg/mL标准溶液。

调查问卷参考“英美两国老年痴呆预防指南”并结合青岛市老年痴呆早期发病案例及其它相关文献的基础上自行设计,并请相关专家对问卷内容进行评议、修改和表面效度测定,进行预调查20名后形成正式问卷。问卷内容分为三部分:①一般资料问卷:包括年龄、性别、社区服务中心名称、职称、学历、护理工作年限、社区工作年限、是否参加过临床工作等。②社区护士对老年痴呆预防及早期干预总体认知情况。③所在社区对老年痴呆预防及早期干预现状。其中社区护士对老年痴呆预防及早期干预总体认知部分18题,老年痴呆预防及早期干预现状18题。

甲醇为色谱纯；乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸铵溶液、醋酸、醋酸钠、碳酸、碳酸氢钠等均为分析纯。

（二）检测方法

1.仪器条件

液相条件:色谱柱HyPuRiTY C18ODS（2.1mm× 150mm Column）（Thermo公司生产）,流速0.20mL/min，采集时间15min，进样量10.0 L；流动相为甲醇5mmol/L:乙酸铵溶液(pH=3.0～4.0)=70:30。

质谱条件：采用电喷雾电离（IonSprary）-阳离子模式（ESI+）进行MRM方式检测，碰撞能量（CE）为35.0V，喷射电压5KV，毛细管温度350℃。

2.提取检测方法

取检尿1.0mL倒入硅藻土层析柱中，用二氯甲烷洗脱，收集8.0mL洗脱溶剂，添加5.0 L1.0mg/mL内标SKF525A，于50℃水浴浓缩至干。剩余物用1.0 mL甲醇溶解。0.45 m滤膜过滤后,取10.0 L进行LC-MS/MS分析，以内标标准曲线法进行定量分析。

二、结果与讨论

（一）工作曲线的制备

（二）硅藻土萃取条件的确定

取空白尿液1.0mL，添加100.0 g/mL混合标准工作液1.0 L。分别在pH5、pH7、pH9条件下，用乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯进行洗脱，提取率见表1。

实验发现，尿中士的宁、马钱子碱的提取受pH影响不大，用二氯甲烷作为洗脱溶剂，均能得到较好的提取效果。

（三）仪器条件的确定

1.质谱条件的优化

采用注射泵直接进样的方式，以20.0 L/min将10.0ng/mL的士的宁、马钱子碱标准溶液和SKF525A对照品溶液分别注入离子源中，采用仪器自动调谐的方式，获得最优的质谱检测条件，见表2。在正离子检测方式下对它们进行一级质谱分析，得到2种化合物的分子离子峰，然后分别对准分子离子峰进行二级质谱分析。选择士的宁、马钱子碱和SKF525A的检测离子对，士的宁335.27~264.13，马钱子碱395.58~324.16，SKF525A（内标）354.24~281.30。

表1　尿液中士的宁、马钱子碱在不同pH值及洗脱溶剂条件下提取率考查(n=5)

表2　士的宁、马钱子碱的谱调谐参数

2.液相色谱条件的优化

由于士的宁、马钱子碱和SKF525A易溶于甲醇，选择甲醇作为流动相之一，同时选择水和5mmol/L乙酸铵作为流动相之二。色谱结果表明，加入乙酸铵后峰形明显改善，提示应选择甲醇-5mmol/L乙酸铵作为流动相溶剂。选择不同比例（90∶10,80∶20,70∶30,60∶40,50∶50,40∶60）的甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，分别观察它们的出峰情况，结果显示，甲醇含量减少，出峰时间过长；甲醇含量过大，峰拖尾严重；选择甲醇-5mmol/L乙酸铵比例为70:30时，峰形和保留时间均较为合适。

（四）检出限

取空白尿液1.0mL5份，按文中方法进行提取，添加内标20ng /mL进行测定，得到空白尿色谱图。另取尿添加药物20ng /mL、内标20ng /mL，同上进行提取测定，以“基线噪音”3倍的检材药物含量得检出限。结果检出限士的宁为1.5ng/ mL，马钱子为1.2 ng/ mL。

（五）提取率实验

取1.0mL尿液，分别添加士的宁、马钱子碱0.1、1.0、10.0 g，按照文中方法进行提取、检测，提取率见表3。

表3　尿中士的宁、马钱子碱的提取率(n=5)

（六）毒性实验

取体重2.5kg家兔1只，灌服马钱子碱30mg，15分钟处死，解剖取其血、尿，按本文方法测定。测值为8.7 g/mL。

三、实验结论

在对生物检材中的士的宁和马钱子碱的检验中，需要经提取和仪器检测两大环节。采用硅藻土提取，提取率高、检出限低、去杂质能力强、方法极为简单快速，是目前最好的提取方法之一。采用高效液相色谱－二级质谱联用检测技术，相对其他检测方法而言，灵敏度高、稳定、准确，更适合士的宁和马钱子碱的检测。

【参考文献】

[1]吴玉红,许英键.尿中马钱子碱硅藻土提取紫外三阶导数光谱测定法研究[J].广东公安科技,2004(4):14-16.

[2]吕霞,郭青,钟文英.GC-MS法测定疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药科大学学报,2008(6): 519-522.

[3]王朝虹,果德安,胡春华.反相高效液相色谱法测定全尿中马钱子碱和士的宁的含量[J].色谱,2003(4):382-384.

收稿日期：2014-09-15责任编校：李烽

【基金项目】重庆市高校优秀成果转化项目“药物毒物分析中提取关键技术的成果转化”资助。

【文章编号】1673―2391(2015)01―0144―02

【文献标识码】A

【中图分类号】D631