非小细胞肺癌中VEGF-936C/T多态位点相关分析

非小细胞肺癌中VEGF-936C/T多态位点相关分析

杨桂香1，胡卫盟2，齐迎松2

(1.河北省宽城满族自治县医院，河北宽城067600

2.河北省承德市中心医院，河北承德067000)

摘要：目的：检测非小细胞肺癌患者血清中VEGF表达水平，探讨其与非小细胞肺癌发生和发展的关联性，并检测其基因位点936C/T多态性与非小细胞肺癌的遗传易感性。方法：运用ELISA法及聚合酶链式反应-连接酶检测反应方法检测80例非小细胞肺癌患者和80例健康体检者外周血中VEGF的表达水平，对其基因位点936C/T多态分型进行检测，并分析与非小细胞肺癌的相关性。结果：非小细胞肺癌组VEGF表达水平显著高于对照组，P=0.001(P<0.05)，差异具有统计学意义；两组间的基因型频率(χ2=0.960，0.7500.05)和等位基因频率(χ2=0.968，0.2500.05)差异无统计学差异，基因型与非小细胞肺癌组的相关性分析(PTC=0.554，PTT=0.670，P>0.05)差异亦无统计学意义。结论：VEGF在非小细胞肺癌中呈过表达状态，且VEGF与非小细胞肺癌的发生、发展具有相关性；但VEGF基因位点936C/T多态与非小细胞肺癌的发生、发展并无明显相关性。

关键词：非小细胞肺癌;血管内皮生长因子;单核苷酸多态性;遗传易感

文章编号：1006-6233(2015)09-1559-05

文献标识码：B

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，约占全部恶性肿瘤死亡率的20%，其发生率和死亡率呈逐年上升趋势，其中有80%为非小细胞肺癌[1]。研究发现，非小细胞肺癌恶性度高，预后差，易于早期转移等生物学特性与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有关[2]。VEGF基因具有多态性，然而，在国内关于VEGF基因单核苷酸多态性与肺癌发展关系的报道相对较少，本研究的目的是探讨血清中VEGF表达水平及其基因位点936C/T多态与人群肺癌易感性的关系，进而为非小细胞肺癌的早期风险性评估、早期诊断与预防以及相应的治疗等诸多方面提供依据。

1资料与方法

1.1临床资料:选择我医院2010年9月至2012年5月经病理确诊的非小细胞肺癌患者80例，且患者无其它血管病变，采血前1周内未经过任何手术、放疗、化疗或免疫治疗，其中男52例，女28例，年龄45～72岁，中位年龄55岁，按照世界卫生组织肺癌分类标准：鳞癌32例，腺癌36例，大细胞癌8例，腺鳞癌4例。按照国际抗癌联盟(UICC)第七版标准进行TNM分期，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期39例、Ⅲ期25例)，Ⅳ期6例。对照组为同期健康且排除其它血管病变疾病的体检者80例，其中男54例，女26例，年龄35～76岁，平均52.6岁。所有标本及临床资料的收集均征得患者同意并签署了知情同意书。

1.2主要仪器设备:BioRad450酶标仪、Wizard基因组DNA纯化试剂盒、东胜龙黑金刚EDC-810PCR仪、3730XL基因测序仪、Allegra25R台式高速冷冻离心机、Micro 17R微量台式离心机、微量可调移液器、Taq酶、dNTP、Taq DNA ligase(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1血液标本采集:符合入选标准的所有受检者分别于清晨空腹状态下采肘静脉血4mL于EDTA管中，在1h内离心(3000r/min离心15min)，分离血清，取上清液(eppendorf离心管)，分装保存于-20℃冰箱待测。VEGF血清水平测定采用ELISA法。

1.3.2基因组DNA的提取:上述血液标本3000r/min离心15min，分离血细胞，取沉淀物。DNA的提取采用严格按照Wizard基因组DNA纯化试剂盒的说明书进行纯化提取：取一只1.5mL无菌小离心管，加入900ul细胞裂解液；轻振血样试管，直至彻底混匀，然后将血样转移至上述加有细胞裂解液的离心管中，颠倒混匀5～6次；室温孵育10min(期间颠倒离心管2～3次混匀，一次)裂解红细胞，13,000～16,000xg室温离心20s；能将上清移弃干净，剩余约10～20ul液体；重复上述操作，直到沉淀变白；使用涡旋振荡器(Votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10～15s)；向重悬细胞溶液中加入核裂解液，用移液枪头吸放溶液5～6次裂解白细胞，若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散；向核裂解物中加入蛋白沉淀液100ul，用涡旋振荡器剧烈振荡10～20s；于16,000xg室温离心3min；将其上清转至装有300ul室温异丙醇的1.5mL干净的离心管中；轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状DNA形成沉淀；于16,000xg室温离心1min；弃去上清，加入与样本量等体积的室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次清洗DNA沉淀和管壁，依照12步离心；使用巴斯德吸管或测序加样枪头小心吸走乙醇溶液，此时的DNA沉淀十分松弛，应格外小心避免将DNA沉淀吸进管中。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10～15min；向离心管中加入DNA溶解液 (DNA RehydrationSolution)100ul；65℃孵育1h溶解 DNA。期间可轻弹管壁混匀溶液；2～8℃保存 DNA。

1.3.3SNP分型:采用聚合酶链式-连接酶检测反应方法对VEGF 基因位点936 C/T(rs3025039)进行分型。上游引物为：AAACCTGAAATGAAGGAAGAG，下游引物：GTGGGTGGGTGTGTCTACAGG。TC探针：TTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAC，TT探针TTTTTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAT，TR探针：-P-GGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCTTT-FAM-，扩增目标片段的长度是208bp。PCR反应体系为15ul,94℃预变性3min，然后94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共循环30次，最后72℃延伸3min。LDR反应体系为10ul，94℃30s，56℃3min，循环30次进行连接反应，取1ul延伸产物，加8ul上样loading，95度C变性3min，立即冰水浴，上测序仪。

2结果

2.1非小细胞肺癌组与对照组血清VEGF的表达水平:经检测VEGF血清水平符合正态分布，非小细胞肺癌组VEGF表达平均水平为211.75pg/mL，对照组为150.79pg/mL，非小细胞肺癌组VEGF表达水平显著高于对照组通，P=0.001(P<0.05)，差异有统计学意义，且非小细胞肺癌组平均水平明显高于对照组,，证明VEGF可能与肿瘤的发生发展有相关性。见表1。

表1　非小细胞肺癌组与对照组血清VEGF水平(pg/mL)

2.2VEGF-936C/T等位基因频率的表达:正常对照组VEGF-936C/T等位基因频率经遗传平衡检验，其分布符合Hardy-Weinberg定律(χ2=0.794，P>0.05),说明调查的正常群体具有代表性。VEGF-936C/T基因多态位点的分型结果如图1所示。CC、TT、CT基因型在非小细胞肺癌组中分布频率分别为65.0%、6.3%、28.7%，在对照组中分布频率为70.0%、5.0%、25.0%，两组间基因频率分布差异并无统计学意义(χ2=0.960，0.750

表2　VEGF-936C/T基因型分布及等位基因频率比较 n(%)

2.3VEGF-936C/T基因多态性与非小细胞肺癌遗传易感的关系:在非条件逻辑回归分析中，以CC基因型为参照，TC基因型与CC基因型比较，两组间基因型分布无差异，(OR=1.24，95%CI =0.61～2.52， P>0.05)，TT基因型与CC基因型比较。两组间分布无显著差异，(OR=1.35，95%CI =0.61～2.520.34～5.29，P>0.05)。VEGF-936C/T基因多态性基因型与非小细胞肺癌的遗传易感性并无显著关联。见表3。

图1　VEGF-936C/T多态位点的分型结果图

基因型对照组(n=80)No(%)非小细胞肺癌组(n=80)No(%) OR(95%CI) P值CC56(70.0)52(65.0)1.00TC20(25.0)23(28.7)1.24(0.61～2.52)0.554TT4(5.0)5(6.3)1.35(0.34～5.29)0.670

3讨论

非小细胞肺癌是肺癌最常见的病理类型，肺癌发生侵袭和转移是致使患者死亡的首要原因[3]。大量的研究发现，新生毛细血管的形成是原发实体肿瘤细胞的增殖和生长、转移的必须条件，有多种因素影响新生血管的形成，其中VEGF就是一种高度特异的血管调控因子，在新生血管的形成中起极其重要的作用[4]。大量的研究证实，高表达的VEGF能够促进肿瘤的生长和转移，而当阻断VEGF的信号转导途径时，肿瘤血管生成和肿瘤自身的生长将会受到影响[5]。

研究表明，VEGF在多种肿瘤组织中呈高表达状态，并且与肿瘤的发生发展具有密切的关联性。VEGF是一种同型二聚体糖蛋白，其基因定位于染色体6p21.3，是一个14-kb的编码区，具有8个外显子和7个内含子。VEGF基因中至少有30个单核苷酸多态性位点(SNPs)，目前有研究证实，其中有的位点与VEGF基因自身的表达具有相关性[6]。单核苷酸多态性位点936 C/T(rs3025039)是VEGF基因中最常见的多态位点，有学者报道，在对VEGF-936T多态位点分析进行研究中发现，携带VEGF-936T多态位点者患乳腺癌的危险性较低[7]，而Kammerer等学者研究发现，VEGF-936T基因多态性能促进口腔鳞状细胞癌的进展[8]。VEGF基因单核苷酸多态性位点-2578C/A、-460C/T和+405C/G，参与了肺癌的发展，但关于VEGF936C/T基因多态性与肺癌的关系的研究较少，且对于VEGF936C/T与人群肺癌易感性的关联仍存在争议。

本研究对非小细胞肺癌患者及健康人群中血清VEGF表达水平进行了分析，结果显示非小细胞肺癌组VEGF水平显著高于健康对照组，两者具有统计学差异(p<0.05)。不同分期间VEGF表达水平的比较，研究发现VEGF的水平随着肿瘤分期有逐渐升高的趋势，表明VEGF与非小细胞肺癌的发生发展具有相关性，且可用VEGF水平推测病情进展情况。此外本研究通过对VEGF基因位点936C/T多态性进行分析，结果显示两组间基因型及等位基因差别并无统计学意义；CC、TT、CT基因型在非小细胞肺癌组中分布频率与正常对照组中分布频率的比较结果显示，两组间基因频率分布差异并无统计学意义(χ2=0.960，0.7500.05具体值)。C和T等位基因差异亦无统计学意义(χ2=0.968，0.2500.05)。这与Liu等[9]学者的研究报道相一致。以CC基因型作参照，TC及TT基因型与非小细胞肺癌的发病无明显相关。

参考文献:

[1]Zhang A, Wang C, Wang S, et al. Visualization-aided classification ensembles discriminate lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma samples using their gene expression Profiles[J].PLos One,2014,9:e110052.

[2]Terme M, Tartour E, Taieb J. VEGFA/VEGFR2-targeted therapies prevent the VEGFA-induced proliferation of regulatory T cells in cancer[J].Oncoimmunology,2013,2:25156.

[3]Zhu PS, Poirier CD, Gagnon M,et al. Transbronchial biopsies in lung cancer: Retrospective review of 116 patients[J].Chest,2014,146:795.

[4]Poza-Guedes P, Barrios Y, Fuentes V, et al. Downregulation of angiogenesis factors, VEGF and PDGF, after rapid IgE desensitization and oral immunotherapy in children with food allergy [J].Biomed Res Int,2014,2014:372567.

[5]Galecki P, Galecka E, Maes M, et al. Vascular endothelial growth factor gene (VEGFA) polymorphisms may serve as prognostic factors for recurrent depressive disorder development[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2013,45:117～124.

[6]Supic G, Jovic N, Zeljic K, et al. Association of VEGF-A genetic polymorphisms with cancer risk and survival in advanced-stage oral squamous cell carcinoma patients[J].Oral Oncol,2012,48:1171～1177.

[7]Yan Y, Liang H, Li T, et al. Vascular endothelial growth factor +936C/T polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis of 13 case-control studies[J].Tumour Biol,2014,35:2687～2692.

[8]Kammerer PW, Al-Nawas B, Kalkan S, et al. Angiogenesis-related prognosis in patients with oral squamous cell carcinoma-role of the VEGF +936 C/T polymorphism[J].Oral Pathol Med,2014,23:1064～1063.

[9]Liu XL, Yang QF, Kong BH. Vascular endothelial growth factor +936C/T polymorphism and cancer risk in Asians: a meta-analysis[J].Genet Mol Res,2013,12:1924～1933.