白藜芦醇对去卵巢大鼠皮肤衰老及沉默信息调节因子表达的影响

白藜芦醇对去卵巢大鼠皮肤衰老及沉默信息调节因子表达的影响

况晓东漆文萍1鄢敏肖雯胡明华艾有生熊小亮

(南昌大学医学院病理教研室,江西南昌330006)

摘要〔〕目的建立卵巢切除术后皮肤老化模型，观测白藜芦醇对卵巢切除术后大鼠皮肤衰老的影响。方法将56只Wistar雌性大鼠随机分成7组：空白对照组、去卵巢组、雌激素治疗组、白藜芦醇治疗组(低、中、高剂量)以及白藜芦醇和他莫昔芬联合治疗组。大鼠处死后取皮肤组织，部分组织测定其生物活性酶，部分组织采用Western 印迹方法检测沉默信息调节因子(SIRT)1蛋白表达。结果白藜芦醇治疗组(中、高剂量)、雌激素组分别与去卵巢组比较，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显增高、羟脯氨酸含量增加，丙二醛含量降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表达明显增强。并且采用雌激素受体拮抗剂他莫昔芬处理后，能够明显拮抗白藜芦醇组上述作用(P<0.05)。结论白藜芦醇通过雌激素受体发挥抗皮肤衰老作用，并且这一作用与SIRT1蛋白调节有关。

关键词〔〕白藜芦醇；雌激素；皮肤衰老；SIRT1

中图分类号〔〕R751.05〔文献标识码〕A〔

基金项目：江西省卫生厅课题(No.20092029)

1南昌大学经济与管理学院

第一作者：况晓东(1976-)，男，博士，讲师，主要从事炎症与衰老病理学研究。

随着年龄的增长，皮肤会像人体的其他器官一样逐渐老化，对人们的生活、工作有着复杂的心理与生理影响，尤其对女性的影响更大〔1〕。女性围绝经期是皮肤衰老的重要时期，在此期间，皮肤组织中产生大量的自由基、激素分泌失调等导致皮肤老化。因此，抗衰老治疗，尤其是对皮肤的抗衰老治疗成为近年来的研究焦点之一。研究发现，白藜芦醇在抗衰老方面作用广泛而又显著〔2,3〕。目前已证实摄入白藜芦醇能使酵母、线虫、果蝇和低等鱼类等的寿命延长。白藜芦醇在《抗衰老圣典》一书中被列为“100种最热门的有效抗衰老物质”之一，而以白藜芦醇为有效成分的红葡萄酒还能够起到美容抗衰老的作用。本实验拟在去卵巢大鼠模型的基础上，观察对皮肤衰老指标的影响，明确白藜芦醇的抗皮肤衰老的作用及机制。

1材料和方法

1.1材料成年Wistar雌性大鼠(南昌大学医学院实验动物中心提供)，2～3月龄，体重(235±23)g。考马斯亮蓝试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒和羟脯氨酸(HYP)试剂盒(南京建成生物制品)。白藜芦醇(成都思科华公司)，苯甲酸雌二醇注射液(上海通用制药有限公司)。沉默信息调节因子1(SIRT1)一抗(USA)，GAPDH(USA)；辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(GenScript，USA)。

1.2方法

1.2.1实验动物造模去卵巢大鼠模型制作：大鼠适应1 w后，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉、固定，背部切口切除双侧卵巢，对照组切除部分脂肪组织，分层缝合。去势术后连续3 d腹腔注射青霉素(5万U/只)，以防术后感染。术后第四天开始进行阴道脱落细胞涂片检测，连续7 d时间，如涂片中未见成熟脱落上皮细胞，无动情周期性变化为模型成功。

1.2.2实验分组及大鼠皮肤组织酶含量测定56只成年Wistar雌性大鼠被随机分为7个组：空白对照组、去卵巢组、雌激素治疗组、白藜芦醇治疗组(低、中、高剂量)(10、30、60 mg/kg)以及白藜芦醇与他莫昔芬联合治疗组(50 mg/kg他莫昔芬+ 60 mg/kg 白藜芦醇)。除空白对照组，所有各组均采取去势手术。每日灌胃1次，第31天处死动物并取材。

取背部脱毛后的皮肤组织约50 mg，制备10%皮肤组织匀浆，采用硫代巴比妥酸(TBA显色法)测定皮肤中MDA的含量，用化学比色法测定HYP含量，用邻苯三酚自氯法测定SOD的活性；取背部脱毛后的皮肤组织，经蛋白裂解液裂解后，Western 印迹方法检测SIRT1蛋白表达情况。

1.2.3Western 印迹检测大鼠皮肤组织中SIRT1 蛋白表达皮肤组织经裂解后，收集上清液即为蛋白质粗提物，BCA法测定蛋白质浓度，上样前稀释至相同浓度等量上样进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，SIRT1一抗4℃孵育过夜，TBST冲洗3次，每次10 min；HRP 标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL显色，曝光(以GAPDH做内参)。

2结果

2.1白藜芦醇对大鼠皮肤组织酶含量的影响与空白对照组相比，去卵巢组大鼠皮肤中的SOD、HYP的含量均显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。雌激素治疗组、白藜芦醇治疗组(中、高剂量)大鼠皮肤中SOD、HYP含量与去卵巢组相比均显著增加(P<0.05)，并且显示他莫昔芬用药前后SOD、HYP含量有显著差异(P<0.05)，而白藜芦醇低剂量组与去卵巢组比较无显著差异(P>0.05)；MDA 含量比较，显示雌激素治疗组、白藜芦醇治疗组(低、中、高剂量)大鼠皮肤中MDA 显著降低(P<0.05)，但是他莫昔芬用药前后MDA 含量则无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2白藜芦醇对大鼠皮肤组织中SIRT1蛋白含量的影响空白对照组、去卵巢组、雌激素治疗组、白藜芦醇高剂量治疗组、白藜芦醇与他莫昔芬联合治疗组均可见清晰条带，且雌激素治疗组、白藜芦醇高剂量治疗组条带明显强于去卵巢组，而白藜芦醇与他莫昔芬联合治疗组条带与白藜芦醇高剂量治疗组相比条带明显减弱。见图1。

组别SOD(μg/mg)MDA(mmol/mg)HYP(μg/mg)空白对照组52.908±3.0903.998±0.2443.639±0.221去卵巢组34.799±2.7871)9.043±0.7621)1.555±0.3711)雌激素治疗组46.351±3.6202)7.072±0.1882)2.793±0.2192)白藜芦醇低剂量治疗组37.141±1.6827.372±0.1462)2.027±0.182白藜芦醇中剂量治疗组41.077±2.2442)7.160±0.1762)2.443±0.662)白藜芦醇高剂量治疗组43.203±2.0312)6.668±0.3622)3.009±0.4792)白藜芦醇与他莫昔芬联合治疗组37.154±4.6863)7.157±0.0922.206±0.1753)

与空白对照组比较：1)P<0.05；与去卵巢组比较：2)P<0.05；与白藜芦醇高剂量治疗组比较：3)P<0.05

1：空白对照组；2：去卵巢组；3：雌激素治疗组；4：白藜芦醇高剂量治疗组；5：白藜芦醇与他莫昔芬联合治疗组 图1　Western印迹检测各组大鼠皮肤组织SIRT1蛋白表达

3讨论

研究表明〔4〕，采用雌激素替代疗法能显著改善皮肤衰老带来的问题。然而，雌激素作为化妆品成分使用是受到严格限制的，研究资料显示，动物雌激素增加了子宫内膜癌和乳腺癌发生的危险性〔5〕。近期研究发现，植物雌激素对人体或动物能发挥类似动物雌激素样的活性，却少有雌激素样副作用的发生。白藜芦醇作为一种植物雌激素，通过与体内不同雌激素受体位点结合而表现雌激素激动或拮抗活性。

研究发现〔2〕，白藜芦醇可能是研发抗衰老药物的关键。但是有关在皮肤衰老方面的研究尚属罕见，目前为止仅有1篇文献报道〔6〕：该文采用体外细胞实验的方法证实白藜芦醇能够通过P53、JNK途径实现抗皮肤衰老作用，但是白藜芦醇作为植物雌激素方面的作用并无涉及。在衰老过程中，机体对自由基的清除能力逐渐降低，其代谢产物在组织中不断堆积。MDA是自由基脂质过氧化的分解产物，其水平的变化间接反映了组织中自由基的变化。清除自由基的酶类主要有SOD、过氧化氢酶(CAT)、以GSH-Px为代表的过氧化物酶及谷胱甘肽硫转移酶(G-ST)等。胶原蛋白的主要成分是HYP。机体衰老时，皮肤内部成纤维细胞供氧不足，羟脯氨酸合成减少，进而皮肤内的蛋白质含量也降低。通过测定HYP的含量可以判断受试动物皮肤衰老的程度。本实验结果结果表明白藜芦醇可以像雌激素一样，对抗来自于雌激素下降所带来的皮肤衰老的问题。雌激素受体拮抗剂他莫昔芬能够影响白藜芦醇的这一作用，进一步表明白藜芦醇可能通过雌激素受体发挥抗皮肤衰老的作用。

近来研究表明，SIRT1可通过其去乙酰化作用来调节蛋白质的功能，并具有抗衰老作用。而白藜芦醇可以作为最强的SIRT1激活剂，可模拟热量限制抗衰老反应，参与有机生物平均生命期的调控〔7〕。雌激素样作用和SIRT1作用均具有抗衰老的作用，而白藜芦醇同时兼具雌激素样作用和SIRT1作用，因此有理由相信Res在抗皮肤衰老方面必然有着美好的开发前景。

4参考文献

1Archer DF.Postmenopausal skin and estrogen〔J〕.Gynecol Endocrinol,2012;28(Suppl 2)：2-6.

2Wood JG,Rogina B,Lavu S,etal.Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans〔J〕.Nature,2004;430(7000):686-9.

3郭燕世.热量限制与白藜芦醇抗衰老的研究进展〔J〕.生理科学进展,2011;42(3):161-4.

4Ganceviciene R,Liakou AI,Theodoridis A,etal.Skin anti-aging strategies〔J〕.Dermatoendocrinology,2012;4(3):308-19.

5Angelousi AG，Anagnostou VK，Stamatakos MK，etal.Mechanisms in endocrinology:primary HT and risk for breast cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Eur J Endocrinol,2012;166(3):373-81.

6Cao C,Lu S,Kivlin R,etal.SIRT1 confers protection against UVB- and H2O2-induced cell death via modulation of p53 and JNK in cultured skin keratinocytes〔J〕.J Cell Mol Med,2009;13(9B):3632-43.

7Baur JA,Ungvari Z,Minor RK,etal.Are sirtuins viable targets for improving health span and lifespan〔J〕?Nat Rev Drug Discov,2012;11(6):443-61.

〔2014-05-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)