山姜素对急性重症胰腺炎大鼠肺损伤中水通道蛋白-1表达的影响

山姜素对急性重症胰腺炎大鼠肺损伤中水通道蛋白-1表达的影响

聂容荣袁晟光1刘杰1余水平1唐芳2唐博1

(桂林医学院附属医院中医科,广西桂林541001)

摘要〔〕目的探讨山姜素对急性重症胰腺炎(SAP)肺损伤的保护作用是否与水通道蛋白(AQP)-1表达相关。方法选取60只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组(Control组)，假手术组(Sham组)、模型组(SAP组)、山姜素治疗组(Alpinetin组)每组15只。以逆行注入15 g/L 熊去氧胆酸钠(1 ml/kg)30 s注射制作SAP模型。各组均于造模8 h后剖杀，提取肺组织。检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、湿/干重比及对肺脏进行病理学评分；取材测定血清肿瘤坏死因子(TNF)-α含量；RT-PCR检测肺组织AQP-1 mRNA的表达，免疫组化法检测肺组织AQP-1的表达。结果SAP组与Sham组相比，SAP组肺组织损害程度明显升高(P<0.01)，血清TNF-α，MPO活性明显增加(P<0.05)。AQP-1 mRNA与AQP-1蛋白表达显著下调(P<0.05)。Alpinetin组与SAP组相比，Alpinetin组肺干/湿比值、肺组织病理损害程度、血清TNF-α明显降低(P<0.05)，AQP-1 mRNA和AQP-1蛋白表达则明显升高(P<0.05)，AQP-1表达水平与TNF-α呈负相关。结论应用山姜素能够对SAP肺损伤起到明显的保护作用，其机制可能与抑制肺组织分泌TNF-α和上调AOP-1水平有关。

关键词〔〕山姜素；急性重症胰腺炎；肺损伤；水通道蛋白-1

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：广西壮族自治区中医药管理局中医药科技专项基金资助(GZPT13-45)

通讯作者：唐博(1979-)，男，副主任医师，博士，主要从事肝胆胰外科临床与基础研究。

1桂林医学院附属医院肝胆外科2桂林医学院附属医院病理科

第一作者：聂容荣(1981-)，男，副主任医师，博士，主要从事中医肝病临床与基础研究。

急性重症胰腺炎(SAP)病情凶险，死亡率高，严重者导致全身炎症反应综合征(SIRS)，从而导致多器官障碍〔1,2〕。其中最常见的是急性肺损伤(ALI)〔3〕，是临床上难治之症。SAP在中医学中属于“胃脘痛”、“脾心痛”范畴。《内经》有言，肺与大肠相表里。若肺脏功能失调，易致大肠之气发生郁塞。此时如能通导大肠，使得大肠腑气得以通调，则可促使肺之肃降功能恢复正常。肺为相傅之官而朝百脉，百脉顺，则诸症可解〔4〕。本课题前期进行了山姜素治疗SAP的临床预实验，抗ALI效果令人满意。本研究旨在进一步明确山姜素是否通过上调水通道蛋白(AQP)-1的表达来达到减轻ALI的效果。

1材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠60只，体重(250±20)g。动物分笼饲养，自由饮水，喂标准颗粒饲料，室温(20±2)℃，动物及饲料均购由桂林医学院实验动物中心提供。实验研究经过桂林医学院附属医院伦理委员会的批准。

1.2药品及试剂山姜素购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α的ELISA检测试剂盒，髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒，AQP-1抗体、免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3动物模型与分组大鼠随机分为正常对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、模型组(SAP组)、山姜素治疗组(Alpinetin组)，每组15只。所有大鼠禁食、自由饮水12 h，1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。正常对照组不做任何手术处理。Sham组模拟造模手术情况，开腹后仅轻度揉搓胰腺、翻转肠管5 min后即关腹。SAP组采用20 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，动物腹部剃毛，消毒术区皮肤，无菌条件下经正中切口入腹，在十二指肠乳头对侧肠壁插入1 ml小注射器针头经胰腺胆管十二指肠乳头开口入胰胆管，同时在胆管出肝门处用小动脉夹夹闭，逆行注入15 g/L熊去氧胆酸钠(1 ml/kg)30 s注射造模。Alpinetin组在SAP造模后0.5 h内，灌服山姜素80 mg/ml。

1.4标本采集及检测各组大鼠造模或术后8 h后处死，经腹主动脉采血，离心后血清置-70℃冰箱保存备用。

1.4.1肺干/湿比值测定动物放血致死后无菌操作下取左肺叶称湿重，置60℃烤箱连续烘烤24 h，去除水分后称干重。

1.4.2肺组织病理形态观察无菌操作下取出右肺下叶行常规甲醛固定、石蜡包埋，切片5 μm，HE染色观察，并行病理学评分。

1.4.3血清MPO及TNF-α含量测定大鼠解剖胸腔暴露肺，夹闭右肺下叶支气管。自主支气管灌入无菌生理盐水，每次8 ml，共5次，收集灌洗液。将灌洗液以2 000 r/min离心10 min，弃去上清。将沉淀用RPMI1640培养液悬浮，计数细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，置24孔细胞培养板中。于37℃、5% CO2中培养1 h，用温培养液冲洗2次，去除未黏附细胞。然后将黏附细胞再置于培养液中培养24 h，取上清用于检测 TNF-α。TNF-α与MPO检测用ELLSA法。

1.4.4肺组织中AQP-1免疫组化检测取右肺组织常规脱水、包埋制成蜡块，用于免疫组化染色，采用SP法，PBS代替一抗作为阴性对照，按免疫组化试剂盒说明书操作。

1.4.5肺组织中AQP-1 mRNA表达检测取右肺组织，提取总RNA。RT-PCR采用一步法。AQP-1引物设计，上游为：5′-ATGGCCAGCGAAATCAAGAAG-3′，下游引物为5′-GATATCATCAGCATCCAGGTC-3′。β-actin作为内参照，其引物设计：上游为5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游为5′-CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC-3′。PCR反应条件：94℃预变性5 min，98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，循环30次，72℃延伸1 min，最后降至4℃结束反应。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳后采用凝胶成像系统记录分析。

1.4.6肺组织中AQP-1蛋白表达Western印迹分析肺组织AQP-1蛋白表达代替。

1.5统计学方法采用SPSS18.0统计软件行方差分析。

2结果

2.1大鼠一般情况及死亡率观察Control组与Sham组大鼠一般状况较好，术后无死亡发生。SAP组大鼠一般状况差，出现精神萎靡、反应迟钝、懒动、竖毛、呼吸急促、拒食等表现，24 h死亡率高达50%。Alpinetin组大鼠的一般状况较模型组有不同程度的改善，24 h死亡率也有显著下降。

2.2肺脏病理学评分Control组与Sham组肺脏病理学大体观：肺脏形态、结构基本正常。SAP组肺脏表面暗红并伴有点片状出血灶，水肿明显。Alpinetin组肺脏见少量出血点，水肿轻。肺泡腔融合形成肺大泡.随着时间延长，上述表现呈逐渐加重趋势。按文献〔5〕肺组织病理评分标准，Control组组织学评分显著高于Sham组〔(0.41±0.43) vs(0.37±0.48),P<0.01〕，而Alpinetin组肺组织炎症反应明显减轻〔(0.81±0.48)〕，组织学评分显著低于SAP组〔(1.93±0.64),P<0.01〕。

2.3血清及肺组织各项指标表1可见，Sham组、Alpinetin组

组别TNF-α(μg/L)MPO(U/g)肺湿/干重比AQP-1mRNAAQP-1蛋白Control组56.31±5.822.82±0.426.53±0.380.782±0.026197±6Sham组74.31±6.433.42±0.726.31±0.250.812±0.029201±7SAP组216.8±15.1311.32±1.269.75±0.370.362±0.01197±5Alpinetin组100.48±30.121)6.91±1.721)6.62±0.411)0.773±0.0121)162±81)F/P值13.37/08.01/021.95/097.78/026.68/0

与SAP组比较：1)P<0.05

与SAP组相比血清TNF-α，MPO水平明显降低(P<0.05)。SAP组肺干/湿比值明显增加，Alpinetin组与其相比肺干/湿比值减少(P<0.05)。SAP组AQP-1 mRNA表达较Sham组显著下调(P<0.05)，而Alpinetin组较SAP组AQP-1 mRNA表达明显上调(P<0.05)(图1)。SAP组AQP-1蛋白表达较Sham组明显下调(P<0.05)，Alpinetin组AQP-1蛋白表达较SAP组明显上调(P<0.05)(图2)。

图1　各组大鼠造模后肺组织AQP-1 mRNA表达结果

图2　各组大鼠造模后肺组织AQP-1蛋白表达结果

3讨论

SAP并发ALI〔3〕，其病情发展迅速，死亡率高，是临床上难治之症。ALI治疗的难点之一是因为胰源性肺损伤的发病机制不甚明了。目前研究表明，胰源性肺损伤的发病机制与一系列因素有关，如细胞因子与炎症介质过度释放〔6，7〕，细胞凋亡〔8〕，中性粒细胞及巨噬细胞过度积聚〔7〕等。TNF-α是其中较为重要的炎症介质〔9，10〕。MPO是一种重要的含铁溶酶体，是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用〔11〕。

AQP是与水的快速转运密切相关的细胞膜蛋白家族〔12,13〕，现已发现11种亚型，在肺组织内分布的有AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5四种，其中肺微血管内皮细胞中AQP-1含量相对较高〔14〕。AQP-1已经被证实参与了多种肺损伤性疾病的病理过程〔15〕。AQP-1在SAP并ALI时表达与肺水肿的严重程度呈负相关〔13〕。SAP在中医学中属于“胃脘痛”、“脾心痛”范畴。《灵枢·本输》云：“肺合大肠”，肺属太阴，大肠属阳明。五行同属金。肺与大肠生理上相互协调，病理上相互影响，治疗上相互为用。现代研究表明〔14〕，消化管、呼吸道的上皮组织大多来源于原始消化管的内胚层，这种胚胎学上的共同来源被认为是“肺与大肠相表里”的生理结构基础。中医学认为，SAP病程中，因肺失肃降，使得大量的有毒物质积聚体内，肠道也因此发生传导阻滞，出现腑实壅盛，里热积聚等证。此时如能选取合适的方法通利大肠，使肠腑之气得以通降，则肺之肃降功能也可恢复正常，肺气喘逆等症也能随之改善。

《名医别录》载：豆蔻味辛，温，无毒。主温中、心腹痛、呕吐。草豆蔻具有燥湿健脾、温胃止呕的功效，在中医临床上用于寒湿内阻、脘腹冷痛、嗳气呃逆、不思饮食等症。山姜素是姜科植物草豆蔻种子团中的主要成分，其结构式分别为7-羟基-5-甲氧基二氢黄酮。现代药理学研究表明，山姜素具有明显的抗菌、抗炎作用〔16，17〕。前期临床预实验表明，山姜素具有通里攻下作用，能促进胃肠道排空，减少肠道细菌易位，从而起到清热解毒，抑制肺组织多种细胞因子及炎症介质的释放，发挥通腑保肺的作用。本实验说明山姜素可有效抑制中性粒细胞在肺组织的聚集，进而减轻SAP并发的ALI。因此，山姜素对SAP肺组织具有较全面的保护作用，可能是上调AQP-1的表达来抑制TNF-α的分泌，达到减轻肺损伤的效果。

4参考文献

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〔2014-04-19修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

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