红藻氨酸致痫大鼠海马Cav-1、EphrinA2蛋白的变化及肉桂醛的干预作用

2015-12-30 09:07金玉玲,臧兆平,罗海龙
中国老年学杂志 2015年8期
关键词:颞叶肉桂海马

红藻氨酸致痫大鼠海马Cav-1、EphrinA2蛋白的变化及肉桂醛的干预作用

金玉玲臧兆平1罗海龙2李欣李玲3董红梅

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探讨肉桂醛对红藻氨酸(KA)致痫大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的影响。方法60只雄性Wistar大鼠随机分成正常组、NaCl组、癫痫组、肉桂醛低剂量(25 mg/kg)组、肉桂醛中剂量(37.5 mg/kg)组及肉桂醛高剂量(50 mg/kg)组。癫痫组和肉桂醛治疗组均采用大鼠脑右侧海马CA3区一次性注射1 μg/μl KA 1μl诱发癫痫发作,NaCl对照组注射等量NaCl溶液,观察其行为学表现,Western印迹检测各组大鼠海马组织Cav-1和EphrinA2蛋白的表达。结果实验性癫痫大鼠模型制作成功,肉桂醛各剂量组和癫痫组实验动物全部达到点燃标准,肉桂醛治疗组大鼠癫痫发作潜伏期延长,发作时间明显缩短,发作级别降低。海马区Cav-1和EphrinA2蛋白的表达在正常组与NaCl组无差异(P>0.05);与NaCl组比较,癫痫组大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白表达均明显增加(P<0.01);肉桂醛各治疗组大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的表达低于癫痫组(P<0.05),且与肉桂醛浓度有关。结论KA海马区注射可获得稳定的癫痫大鼠模型,肉桂醛通过降低大鼠海马Cav-1和EphrinA2蛋白的表达,起到抗癫痫作用。

关键词〔〕癫痫;肉桂醛;小窝蛋白-1;EphrinA2

中图分类号〔〕R742.1〔文献标识码〕A〔

基金项目:黑龙江省教育厅项目(No.12521572)

1齐齐哈尔医学院附属第三医院

2牡丹江医学院附属红旗医院3吉林省东丰县医院

第一作者:金玉玲(1969-),女,副主任医师,硕士生导师,主要从事脑损伤机制和防治的研究。

癫痫(EP)是一种最常见的世界性的神经系统难题,为多种病因引起的神经系统异常放电造成以突发性、暂时性脑功能失常为特征的脑功能障碍综合征。EP患者需要长期服用抗EP药物控制EP发作时间及频率,但仍有20%左右的患者经长期正规药物治疗后仍难以控制而形成难治性EP,且目前抗EP药物虽应用于临床,但只是控制症状,长期应用可导致认知功能障碍等副作用。因此,寻求一种特异性强、副作用小的抗EP药物具有十分重要的意义。肉桂醛具有抗菌、降低血糖和抗肿瘤等作用〔1,2〕,但在EP方面的研究甚少。

1材料和方法

1.1试剂兔抗小窝蛋白(Cav)-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,兔抗EphrinA2多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司;牛血清白蛋白和红藻氨酸(KA)购自美国sigma公司;碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组60只成年健康雄性Wistar大鼠,3~5月龄,体重200~250 g,由哈尔滨医科大学动物实验中心提供(许可证号:医动字第09-2号),分笼适应喂养>1 w。随机将其分为六组,每组10只:EP组(大鼠CA3区注射KA致癫),肉桂醛低剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫,连续7 d腹腔予肉桂醛25 mg/kg),肉桂醛中剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫,连续7 d腹腔予肉桂醛37.5 mg/kg),肉桂醛高剂量组 (大鼠CA3区注射KA致癫,连续7 d腹腔予肉桂醛50 mg/kg),正常组(大鼠CA3区不注射),NaCl组(大鼠CA3区注射NaCl,连续7 d腹腔给等量NaCl溶液)。

1.2.2动物模型制备Wistar大鼠以10%水合氯醛0.3~0.4 ml/kg腹腔注射麻醉,固定于脑立体定位仪上,按照Paxinos&Watson大鼠脑立体定向图谱,以前囟为靶点定位:X=2.5 mm(右),Y=3.0 mm,Z=3.5 mm;根据前囟标记点和Paxinos&Watson脑功能定位图谱钻孔,并参照大鼠的颅骨解剖图,穿刺海马CA3区,无菌且实验动物清醒条件下,用 1 μl微量注射器注入浓度为1.5 μg/μl的KA 1 μl(每次注射前以NaCl溶液新鲜配制),注射药物时间每次持续10~15 min,0.1 μl/1 min,留针5 min。根据KA诱发大鼠的行为学改变判定EP大鼠模型的建立。NaCl组相同部位等时注入等量的NaCl溶液。

1.2.3大鼠行为学观察大鼠海马局部注射KA或NaCl后,观察行为学变化。EP大鼠发作行为学变化的分级标准:0级:正常行为状态,无发作反应;Ⅰ级:咀嚼、眨眼、立须等口周及面部肌肉抽搐,湿狗样颤动;Ⅱ级:以点头运动为主要表现的颈部肌肉抽搐;Ⅲ级:前肢阵挛、抽搐;Ⅳ级:双侧前肢伸直,伴有身体的立起;Ⅴ级:跌倒和全身惊厥。Ⅲ级以下为复杂部分发作,Ⅳ级和Ⅴ级为全身强直阵挛发作〔3〕。注药后立即进行行为学观察,海马局部注射KA的大鼠,在1 h内出现Ⅰ~Ⅴ级行为变化的归为EP模型。

1.2.4Western印迹法进行蛋白测定海马组织样品蛋白裂解液与5倍上样缓冲液混合,100℃变性5 min,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后,40 V,电转移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜。PVDF封闭过夜,Cav-1蛋白和EphrinA2蛋白兔源多克隆抗体37℃,2 h,辣根过氧化物酶标记二抗37℃,1 h,Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗。增强化学发光法(ECL)显色试剂显色,对照Marker记录实验结果。将结果进行拍照,用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.3统计学方法应用SPSS11.5软件行t检验。

2结果

2.1行为学观察注射KA后,麻醉未醒的30 min内,大鼠安静,偶见眨眼、动须、面肌抽搐;苏醒后,大鼠咀嚼、眨眼、动须、动耳(Ⅰ级)及点头、翘尾(Ⅱ级);继之出现对侧前肢阵挛(Ⅲ级),双侧前肢阵挛(Ⅳ级),四肢抽搐、跌倒(Ⅴ级);在30~60 min出现EP持续状态(SE),每次发作时间持续数分钟至数小时,反复多次。EP组及肉桂醛各用药组大鼠每天注射KA后均有不同程度的EP发作表现,EP组实验动物在注射KA后1~7 min内即开始发作,每次发作持续时间不等,在肉桂醛注射初期与EP组发作相仿,潜伏期稍长,用药后期,潜伏期延长,发作时间明显缩短,发作级别降低且少有大发作。正常组无任何异常行为表现。肉桂醛各用药组和EP组均出现Ⅲ级以上多次EP发作,比较其潜伏期和到达重型发作时间有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠EP发作潜伏期、到达重型发作

与EP组比较:1)P<0.01:2)P<0.05

2.2EP大鼠海马 Cav-1和EphrinA2蛋白的表达NaCl组和正常组Cav-1(0.51±0.05 vs 0.53±0.05)和EphrinA2蛋白(0.60±0.03 vs 0.60±0.05)的表达无差异(P>0.05);EP组大鼠海马Cav-1蛋白(0.86±0.03)和EphrinA2蛋白(0.82±0.04)的表达显著高于NaCl组(P<0.01);与EP组比较,肉桂醛低、中、高剂量组Cav-1蛋白(0.78±0.04、0.71±0.03、0.65±0.02)和EphrinA2蛋白(0.73±0.03、0.67±0.02、0.61±0.04)的表达明显降低(P<0.05)。见图1。

1:正常组;2:NaCl组;3:EP组;4:肉桂醛低剂量组;5:肉桂醛中剂量组;6:肉桂醛高剂量组 图1 大鼠海马组织 Cav-1和EphrinA2蛋白的表达

3讨论

颞叶EP(TLE)是难治性EP的主要类型,是一种主要起源于内侧颞叶的部分发作性EP。KA,即海人酸,首先由日本人从海藻中提取出来,其结构类似于谷氨酸,能产生很强的神经兴奋作用。它可以与突触后膜的海人酸受体(海马CA3区的KA受体最多)结合,产生兴奋性突触后电流,导致动物EP发作,即为海人酸EP模型。KA模型是常用的EP持续状态模型及自发发作模型〔4〕。本实验直接将KA注射到雄性Wistar大鼠海马CA3区,由于海马病变引起的继发性EP的行为症状、特异性的海马损伤病理改变及复发的自发性抽搐,类似人类的颞叶EP,所以取CA3区为注射药物的作用点更直接、更方便,也更容易出现颞叶EP的病理学改变。

EP脑损伤是EP发作的结果,也是EP频发和难治的原因。肉桂醛是中药肉桂油的主要成分,肉桂作为一种传统中药,具有镇静、镇痛、解热、抗惊厥等多种药理作用〔5〕。本实验KA通过行为学观察发现,应用肉桂醛后,EP大鼠EP发作潜伏期延长,发作时间明显缩短,发作级别降低且少有大发作,提示肉桂醛可减轻EP发作。

颞叶EP的病理基础是苔藓纤维出芽、异常兴奋环路的形成〔6〕,引起神经元异常放电,增加EP发作的敏感性并促进EP的形成〔7〕。

Cav-1是细胞膜上小窝结构的基本结构蛋白,在小窝结构的维持、多种信号通路的调节中起重要作用。Cav-1不仅参与脂质代谢、调节细胞凋亡、介导内吞作用,还在肿瘤发病过程具有重要作用〔8,9〕。Caveolin蛋白在神经系统中分布广泛,脊髓、底丘脑核、黑质、尾状核和海马等部位的神经细胞和神经胶质细胞中均有Cav-1的表达〔10〕。Cav-1与脑功能的生理和病理变化有关,影响神经发育、突触可塑性等过程〔11〕,且参与阿尔茨海默病(AD)、脑缺血性疾病和出血性脑中风发病过程〔12,13〕,这些证据也暗示Cav-1可能与EP有关。 轴突导向因子是近年有关EP发病研究中的一个热点,正常情况下,在体内低水平表达,主要维持原有轴突和突触稳定并抑制轴突芽生的作用。Ephrins家族是重要的轴突导向因子,而EphrinA2是Ephrins家族成员之一,广泛表达在脑组织尤其是海马中,与EP发作密切相关〔14〕。

相关研究〔15〕发现EphrinA2在颞叶中致痫灶周围的表达水平明显高于正常对照组,与本实验结果一致。Cav-1与EphrinA2关系密切,有研究〔16〕表明缺乏Cav-1导致微血管密度显著降低,而这种结果与EphrinA2受体的失活有关,提示Cav-1-EphrinA2轴促进血管瘤内皮细胞迁移。提示肉桂醛可通过降低Cav-1的表达导致EphrinA2受体失活,抑制轴突导向因子EphrinA2的表达,稳定突触,抑制突触可塑性的激发,从而抑制EP发作。

综上所述,肉桂醛可通过降低EP大鼠海马组织Cav-1蛋白和轴突导向因子EphrinA2蛋白的表达,导致EP大鼠潜伏期延长,发作时间明显缩短,从而降低KA诱导EP大鼠痫性发作,为初步了解肉桂醛抗EP的作用提供一定理论基础。

4参考文献

1裴林,刘春燕,裴逸然,等.天冰调督胶囊对点燃法致癫痫大鼠记忆行为学改变的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(9):2809-11.

2Subash-Babu P,Alshatwi AA,Ignacimuthu S.Beneficial antioxidative and antiperoxidative effect of cinnamaldehyde protect streptozotocin-induced pancreatic β-cells damage in Wistar rats〔J〕.Biomol Ther(Seoul),2014;22(1):47-54.

3Yu C,Liu SL,Qi MH,etal.Cinnamaldehyde/chemotherapeutic agents interaction and drug-metabolizing genes in colorectal cancer〔J〕.Mol Med Rep,2014;9(2):669-76.

4Cross DJ,Cavazos JE.Synaptic reorganization in subiculum and CA3 after early-life status epilepticus in the kainic acid rat model〔J〕.Epilepsy Res,2007;73(2):156-65.

5黄宏妙,郭占京,罗佩卓,等.肉桂水提液对全脑缺血再灌注损伤大鼠羟自由基和谷胱甘肽过氧化物酶的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010;31(16):3083-5.

6Post RM,Weiss SR.Convergences in course of illness and treatments of the epilepsies and recurrent affective disorders〔J〕.Clin EEG Neurosci,2004;35(1):14-24.

7Pitkanen A,Lukasiuk K.Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic pilepsy〔J〕.Epilepsy Behav,2009;14(1):16-25.

8Razani B,Woodman SE,Lisanti MP.Caveolae:from cell biology to animal physiology〔J〕.Pharmacol Rev,2002;54(3):431-67.

9Miyawaki-Shimizu K,Predescu D,Shimizu J,etal.siRNA-induced caveolin-1 knockdown in mice increases lung vascular permeability via the junctional pathway〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006;290(2):L405-13.

10Cameron PL,Ruffin JW,Bollag R,etal.Identification of caveolin and caveolin-related proteins in the brain〔J〕.J Neurosci,1997;7(24):9520-35.

11Gaudreault SB,Blain JF,Gratton JP,etal.A role for caveolin-1 in post-injury reactive neuronal plasticity〔J〕.J Neurochem,2005;92(4):831-9.

12Jasmin JF,Malhotra S,Singh Dhallu M,etal.Caveolin-1 deficiency increases cerebral ischemic injury〔J〕.Circ Res,2007;100(5):721-9.

13Chang CF,Chen SF,Lee TS,etal.Caveolin-1 deletion reduces early brain injury after experimental intracerebral hemorrhage〔J〕.Am J Pathol,2011;178(4):1749-61.

14Xia Y,Luo C,Dai S,etal.Increased EphA/ephrinA expression in hippocampus of pilocarpine treated mouse〔J〕.Epilepsy Res,2013;105(1-2):20-9.

15尹俊锋,张璐,连亚军,等..轴突导向因子EphrinA2在难治性癫痫患者颞叶中的表达〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2012;15(3):21-3.

16Sáinz-Jaspeado M,Huertas-Martinez J,Lagares-Tena L,etal.EphA2-induced angiogenesis in ewing sarcoma cells works through bFGF production and is dependent on caveolin-1〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e71449.

〔2014-03-17修回〕

(编辑袁左鸣)

猜你喜欢
颞叶肉桂海马
肉桂精油和肉桂醛的抑菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究
海马
体寒的人吃点肉桂
正交试验法优选肉桂油的水蒸气蒸馏法提取工艺
记性不好?因为久坐“伤脑”
海马
肉桂醛的调味、保鲜及稳态化研究进展
记性不好?可能是久坐伤脑
额颞叶痴呆伴肌萎缩侧索硬化1例
行为变异型额颞叶痴呆诊断标准的进展