腹腔镜CO2气腹对老年结直肠癌患者缺氧诱导因子－1α、β－链蛋白和E－钙黏蛋白表达的影响

腹腔镜CO2气腹对老年结直肠癌患者缺氧诱导因子-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白表达的影响

程勇王辉张涛韩亮尹美容章烈

(武汉市中心医院胃肠外科，湖北武汉430014)

摘要〔〕目的研究腹腔镜CO2气腹对老年结直肠癌患者缺氧诱导因子(HIF)-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白表达的影响。方法100例接受腹腔镜手术的结直肠癌患者随机分为观察组和对照组，观察组接受腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术，对照组接受CO2气腹腹腔镜手术。比较两组应激反应程度以及肿瘤组织中HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白的表达情况。结果手术中观察组皮质醇、肾上腺素、去甲肾上腺素及促肾上腺皮质激素水平均明显低于对照组(均P<0.05)；观察组肿瘤组织中HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白的表达量低于对照组(均P<0.01)。结论腹腔镜CO2气腹会加重机体的应激反应程度，增加肿瘤组织中HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白的表达。

关键词〔〕CO2气腹；结直肠癌；缺氧诱导因子-1α；β-链蛋白；E-钙黏蛋白

中图分类号〔〕R969.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：湖北省科技厅课题(No.hb(h)2011-3-5-3A-4)

第一作者：程勇(1977-)，男，主治医师，硕士，主要从事胃肠外科研究。

腹腔镜下手术切除手术是近年来临床上广泛采用的结直肠癌微创手术方式〔1〕。在手术过程中，多需要通过CO2气腹来为手术操作创造充足的空间，但是，CO2气腹在维持过程中会影响生命体征稳定并对机体造成较大刺激，同时还会增强肿瘤的恶性生物学行为〔2〕。60岁及以上老年结直肠癌患者由于脏器官功能减退，且多患有多种疾病，更易受到手术所带来的刺激。近年来，腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术逐步发展起来，避免了CO2气腹对机体的刺激和对肿瘤细胞功能的影响。本研究分析腹腔镜CO2气腹对老年结直肠癌患者缺氧诱导因子(HIF)-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白表达的影响。

1资料与方法

1.1一般资料2012年4月至2013年12月腹腔镜下手术的100例结直肠癌患者随机分为观察组和对照组各50例。观察组男34例，女16例；年龄61~80岁，平均(71.32±8.42)岁；结肠癌29例，直肠癌21例；对照组男31例，女19例；年龄61~80岁，平均(71.21±8.18)岁；结肠癌27例，直肠癌23例。两组性别、年龄、类型差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2纳入及排除标准入选标准：①通过影像学检查、肿瘤标记物检查、病理活检确诊为结直肠癌；②TNMⅠ~Ⅲ期；③完善术前相关检查、符合腹腔镜下手术的指征；④告知手术风险、取得知情同意。排除标准：①肿瘤已发生远处转移者；②伴严重心肝肾疾患者；③术前有明显肠梗阻症状者；④术前行新辅助化疗及营养支持者。

1.3手术方法对照组给予CO2气腹腹腔镜手术，方法如下：患者平卧位，全身麻醉后采用4孔法建立气腹，根据肿瘤部位分离对应的结肠系膜和血管，清扫血管周围淋巴结后结扎血管，分离肠系膜并对淋巴结进行清扫，切除肿瘤后行吻合术；观察组给予腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术，方法如下：患者取平卧位，全身麻醉后在耻骨联合上方4 cm处经皮下穿刺2 mm的克氏针，于脐下2 cm处穿出，克氏针两端悬吊在腹壁牵拉装置上以将腹壁吊起，在脐上2 cm出做弧形切口，置入腹腔镜镜头和操作器械，参照对照组方法完成病变肠段的切除。

1.4血清应激反应指标手术前和手术中切除肿瘤时，采集外周血检测皮质醇、肾上腺素、去甲肾上腺素及促肾上腺皮质激素(ACTH)水平。

1.5肿瘤组织中相关分子的蛋白水平取肿瘤组织100 mg，加入RIPA裂解液500 μl，匀浆后于4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清进行下一步检测。按照配方配置4%的浓缩胶和10%的分离胶，在点样孔内加入样本后进行垂直电泳(90 V、20 min，120 V、80 min)和电转膜(100 V、90 min)；取出硝酸纤维素膜用5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST液洗涤3遍后，根据抗体说明书预测蛋白分子量对NC膜进行裁剪，分别孵育HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白、actin第一抗体。第二天取出NC膜并用TBST液洗涤3遍，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TBST液洗涤3遍后进行显影。用Image J软件分析蛋白条带灰度值，按照目的基因灰度值/内参actin灰度值作为蛋白含量，对照组肿瘤组织中的蛋白含量为100，计算观察组肿瘤组织中的蛋白含量。

1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1血清中应激指标水平手术前，两组各项应激指标水平差异无统计学意义；手术中切除肿瘤时，两组均明显上升，观察组皮质醇、肾上腺素、去甲肾上腺素及ACTH水平均明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2肿瘤组织中相关分子的蛋白水平观察组肿瘤组织中HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白的含量均明显低于对照组(P<0.01)。见表2。

表1　两组应激指标水平比较

1)观察组术前、术中比较；2)对照组术前、术中比较；3)观察组与对照组术前比较；4)观察组与对照组术中比较

表2　两组肿瘤组织中相关分子的蛋白水平比较 ± s, n=50)

3讨论

腹腔镜下手术是目前临床上治疗结直肠癌常用的微创手术方式，具有创伤小、手术视野清晰的优势。CO2气腹是腹腔镜下手术时建立手术空间的首选方式，能够为手术操作创造充足的空间、保证手术顺利实施。但是，CO2气腹不可避免会对机体造成刺激并引起手术过程中过度的应激反应〔3〕。在CO2气腹建立和维持的过程中，腹腔压力持续在较高水平，CO2吸收入血造成高碳酸血症，这均会导致交感神经-肾上腺髓质系统及下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统激活，一方面引起肾上腺素和去甲肾上腺素大量释放，导致血流动力学异常和生命体征不稳定〔4〕；另一方面，ACTH、皮质醇大量合成会影响糖脂代谢，导致血糖水平升高、胰岛素大量分泌〔5〕。

腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术是新近发展起来的一项腹腔镜技术，通过悬吊系统的利用来为腹腔镜手术操作创作手术空间，避免了CO2气腹的使用，进而减少了CO2气腹建立和维持过程中对机体造成的刺激以及所引起的应激反应〔6〕。在结直肠癌腹腔镜手术中，也陆续有学者报道了腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术的积极价值〔7〕。本研究说明腹壁悬吊式免气腹单孔腹腔镜手术有助于缓解因CO2气腹而引起的机体应激反应，在结直肠癌根治手术中展现出了积极的价值。

近年来的研究还发现，CO2气腹不仅会对机体造成较为强烈的应激反应，还会增强恶性肿瘤的恶性生物学行为，促进肿瘤细胞发生增殖、侵袭和转移。结直肠癌的增殖、迁移、能量代谢以及血管新生过程受到了一系列分子的调控，包括HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白等〔8〕。HIF-1α是一类与细胞能量代谢、血管新生密切相关的分子，受到血管内皮生长因子、腺苷酸激酶、促红细胞生成素等的调节〔9〕，对于维持肿瘤细胞能量代谢、促进肿瘤新生血管形成等具有重要的价值〔10〕。β-链蛋白是一种多功能的胞质蛋白，一方面可以与E-钙黏蛋白形成复合体并调节细胞间的黏附过程，与结直肠癌细胞的侵入和转移有关〔11〕；另一方面又是Wnt信号通路中关键的下游分子，可以通过与转录因子的结合来促进c-myc、CyclinD等基因的表达来促进恶性肿瘤细胞的增殖、分化过程〔12，13〕。

综上，腹腔镜CO2气腹会加重机体的应激反应程度，增加肿瘤组织中HIF-1α、β-链蛋白和E-钙黏蛋白的表达，进而影响患者预后，其作用机制有待于体外实验或动物实验证实。

4参考文献

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8Lin T，Ponn A，Hu X，etal.Requirement of the histone demethylase LSD1 in Snai 1-mediated transcriptional repression during epithelial mesenchymal transition〔J〕.Oncogene，2010；29(35)：4896-904.

9Cardeno A，Sanchez-Hidalgo M，Rosillo MA，etal.Oleuropein，a secoiridoid derived from olive tree，inhibits the proliferation of human colorectal cancer cell through downregulation of HIF-1α〔J〕.Nutr Cancer，2013；65(1)：147-56.

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11丁杰，廖国庆，张忠民.LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在结肠癌中的表达及其意义〔J〕.中国普通外科杂志，2014；23(4)：462-7.

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13Bennani-Baiti IM，Machado I，Llombart-Bosch A，etal.Lysine-specific demethylase 1(LSD1/KDM1A/AOF2/BHC110)is expressed and is an epigenetic drug target in chondrosarcoma，Ewing's sarcoma，osteosarcoma，and rhabdomyosarcoma〔J〕.Hum Pathol，2012；43(8)：1300-7.

〔2013-12-09修回〕

(编辑苑云杰)