曲美他嗪预处理BMSCs移植对心肌缺血再灌注大鼠心功能改善的影响

曲美他嗪预处理BMSCs移植对心肌缺血再灌注大鼠心功能改善的影响

胡小武1惠杰沈振亚1滕小梅1杨君杰1陈维倩1

(苏州大学附属第一医院心内科，江苏苏州215006)

摘要〔〕目的探讨曲美他嗪(TMZ)预处理骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到缺血再灌注(I/R)微环境下细胞生存及对心功能改善的影响。方法将TMZ预处理或未预处理的BMSCs与心肌细胞H/R上清液共培养，采用CCK-8法检测细胞活性、RT-PCR检测Bcl-2、Bax的基因表达水平。32只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、心肌I/R组、干细胞移植组(BMSCs组)及TMZ预处理干细胞移植组(BMSCs+TMZ组)。建立大鼠心肌缺血再灌注模型，当再灌注平稳后于损伤心肌边缘注入干细胞(细胞数5×105)。1 w后用荧光显微镜观察BMSCs存活数，4 w后应用超声心动图评估心功能，TTC法检测梗死面积，Western印迹分析移植周围区域Bcl-2及Bax的蛋白表达。结果BMSCs与心肌细胞H/R上清液共培养后细胞活性显著下降，但TMZ预处理后使其下降趋势得到明显逆转。RT-PCR结果表明，与未预处理BMSCs相比，在TMZ预处理BMSCs中，Bcl-2基因表达水平上调，Bax基因表达水平下调。在体内，术后1 w，BMSCs+TMZ组每个高倍镜下双标记细胞数显著高于BMSCs组。术后4 w，BMSCs+TMZ组和BMSCs组均较I/R组心功能明显改善，心肌梗死面积缩小；两组间进一步比较，BMSCs+TMZ组表现出了更进一步的心功能改善与更小的心肌梗死面积。Western印迹结果表明，与未预处理BMSCs相比，在TMZ预处理BMSCs组中，Bcl-2表达上调，Bax蛋白下调。结论血运重建联合TMZ预处理BMSCs移植治疗急性心肌梗死增加BMSCs存活和心功能的恢复上优于单纯BMSCs移植，可能通过上调Bcl-2及下调Bax的表达而发挥抗凋亡作用。

关键词〔〕骨髓间充质干细胞；急性心肌梗死；心肌缺血再灌注；曲美他嗪预处理

中图分类号〔〕R541.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30972696)

通讯作者：惠杰(1959-)，男，副教授，主任医师，硕士生导师，主要从事老年冠心病与心律失常的研究。

1苏州大学心血管病研究所

第一作者：胡小武(1987-)，男，在读硕士，主要从事老年冠心病的基础与临床研究。

Effect of trimetazidine preconditioning BMSCs transplantation on myocardial ischemia and reperfusion improved cardiac function in rats

HU Xiao-Wu,HUI Jie,SHEN Zhen-Ya,etal.

Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,Jiangsu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the survival of cells under the microenvironment after trimetazidine (TMZ)pretreatment bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)transplanted to ischemia-reperfusion (analog revascularization)and the influence on cardiac function,and the mechanism.MethodsThe TMZ pretreatment or pretreatment hypoxia/reoxygenation (H/R)BMSCs supernatant of cultured myocardial hypoxia,CCK-8 was used to assay cell activity,RT-PCR was used to detect levels of Bcl-2,Bax gene expression.32 SD rats were randomly divided into Sham,myocardial ischemia and reperfusion(I/R),stem cell transplantation(BMSCs)and TMZ pretreated stem cell transplantation (BMSCs+TMZ)groups.BMSCs survival was observed by fluorescence microscope,four weeks later,the heart function was assessed by echocardiography,infarct size was tested by TTC,the protein expressions of Bcl-2 and Bax around the transplanted area were analyzed by Western blot.ResultsThe activities of cultured cells with BMSCs and cardiomyocytes after H / R supernatants were significantly decreased,but it declined after TMZ pretreatment significantly reversed.Compared with that of non-pretreated BMSCs group,after TMZ pretreatment,the Bcl-2 gene expression level was increased,while Bax gene expression levels was decreased.In vivo,after one week treatment,each high magnification double labeled cells was significantly higher in BMSCs+TMZ group than that of BMSCs group.After four weeks,the heart function was significantly improved in BMSCs+TMZ group and BMSCs group than that of I / R group,myocardial infarct size was reduced.Compared with non-pretreated BMSCs,Bcl-2 expression of BMSCs at TMZ pretreatment group was upregulated,whereas the expression of Bax was lower.ConclusionsRevascularization combined trimetazidine pretreatment BMSCs transplantation on acute myocardial infarction could increase survival of BMSCs and improve recovery of cardiac function.It may be related with upregulating the expression of Bcl-2 and down regulating the expression of Bax.

【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells；Acute myocardial infarction；Myocardial ischemia and reperfusion；Trimetazidine preconditioning

目前可通过及时开通病变血管部分挽救濒临死亡的心肌细胞和通过药物抑制过度的心肌重构，但对已死亡的心肌细胞仍无有效治疗办法。干细胞由于具有自我更新及定向分化为某种特定细胞的能力已开始应用于临床替代治疗AMI和预防心梗后心衰的发生发展。然而，最近的研究显示骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后只有轻微有的甚至没有看到心功能恢复〔1〕，而植入到心肌梗死区域的BMSCs细胞存活率低是主要问题〔2〕。

曲美他嗪(TMZ)作为是一种新型的抗心肌缺血药物，能够选择性地抑制线粒体酶——长链3-酮酰辅酶A-硫解酶(3-KAT)、部分抑制脂肪酸β氧化(高耗氧产能途径)、增进葡萄糖氧化(低耗氧产能途径)，提高心肌细胞氧的利用率，从而增加ATP合成〔3〕，与此同时还能显著减轻细胞内酸中毒、减轻Ca2+超载、减少自由基损害、减少细胞凋亡，从而起到保护心肌细胞的作用〔4〕。本研究拟探讨TMZ预处理BMSCs移植到上述微环境下细胞的生存及对心功能改善的影响机制。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器无特殊病原体级新生1～3 d SD乳鼠28只，健康清洁级雄性SD大鼠32只，体重(200±50)g，由苏州大学实验动物中心提供。TMZ纯粉购自美国Sigma公司，乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化物酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Bcl-2抗体购自美国Cell Signaling Tech 公司，Bax抗体购自英国Abcam公司。流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品，超声心动图检测采用美国GE公司Vivid 7型彩色多普勒超声仪。

1.2BMSCs的分离、培养与鉴定取6～8周龄SD大鼠的胫骨及股骨分离BMSCs，用全骨髓差异贴壁法培养及纯化BMSCs，第3代细胞(P3代)经鉴定后用于实验。

1.3心肌细胞的分离、培养无菌条件下取出新生1～3 d的SD乳鼠心脏，利用酶消化法和差速贴壁法获得原代心肌细胞，取第3天的心肌细胞用于实验。

1.4心肌细胞经缺血再灌注(H/R)处理后上清液的收集与检测将心肌细胞换成无血清的DMEM培养液，放置于37℃、95%N2、5%CO2的缺氧(O2≤2%)培养箱中，3 h后再放于正常培养箱中继续培养2 h。收集细胞培养上清液，并对其中的LDH、MDA及SOD进行检测(按照试剂说明书要求测定)。

1.5共培养的分组及细胞活性检测将P3代BMSCs按相同的细胞密度接种于96孔板中，当细胞生长至接近形成单层时，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗2次，分为四组：Control组为BMSCs+正常细胞培养液，H/R组为BMSCs+H/R上清液，TMZ组为TMZ预处理BMSCs+正常细胞培养液，TMZ+H/R组为TMZ预处理BMSCs+H/R上清液。上述TMZ+H/R组中BMSCs为先以10 μmol/L的TMZ预处理6 h，吸去培养液，用PBS浸洗2次，再加入H/R上清液继续培养12 h。然后用CCK-8法检测共培养后细胞活性，方法如下：(1)向上述每孔中加入10 μl的CCK-8溶液；(2)将培养板在培养箱内孵育2 h；(3)用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。每组3个平行孔，重复3次。

1.6RT-PCR检测Bcl-2、Bax的基因表达以Trizol法提取各组BMSCs的总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录和目的基因的扩增。PCR引物Bcl-2(80 bp)，上游：5′GAACTGGGGGAGGATTGTGG 3′，下游：5′GGGGTGACATCTCCCTGTTG 3′；Bax(128 bp)，上游：5′CTCAAGGCCCTGTGCACTAA 3′，下游：5′TAGGAAAGGAGGCCATCCCA 3′；GAPDH(496 bp)，上游：5′CAAGGTCATCCATGACAACTTTG 3′，下游；5′GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG 3′。

1.7体内移植前细胞标记在体内移植当天用荧光染料CM-Dil标记BMSCs，最后用PBS洗2遍，洗去未结合的CM-Dil，重悬，台盼蓝计数，调整浓度为5×105/100 μl。

1.8I/R造模、实验分组和BMSCs移植以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后将其仰卧固定于动物手术台上。颈正中切口，于3、4气管环处气管切开插入气管插管，连接小动物呼吸机辅助呼吸，设置呼吸频率为90次/min，呼气与吸气比为1∶1，潮气量为35 ml/kg。沿胸骨左缘第4肋间打开胸腔，暴露心脏，打开心包。冠状动脉左前降支(LAD)中、上1/3处穿绕无损伤缝线，将置于LAD下的无损伤缝线双活结结扎，以结扎区室壁运动幅度减弱或消失、颜色变暗紫、心电图相邻的2个导联ST段抬高>0.2 mV为结扎成功标志。维持1 h后，放松结扎线，恢复血流灌注(模拟血运重建)。将标记的BMSCs以浓度为5×105/100 μl装入微量注射器，32只大鼠随机分为四组，每组8只：Sham组假手术组即冠脉只穿线不结扎，I/R组注射不含细胞的上清液，BMSCs组注射无药物预处理干细胞，BMSCs+TMZ组注射药物预处理干细胞。心肌内注射区域为I/R区边缘4个点，每处25 μl，总体积为100 μl，注射成功后可见局部颜色由红色转为白色。

1.9大鼠血清中LDH、SOD及MDA的测定各组SD大鼠于I/R后3 h经股静脉取血2 ml，室温3 000 r/min，离心10 min，获得的血清进行LDH、MDA及SOD的检测(按照试剂说明书要求测定)。

1.10计数荧光标记细胞数量术后1 w，各组随机选2只，经下腔静脉注入10%的氯化钾2 ml，使心脏停搏于舒张期。从胸腔取出心脏，用PBS洗去血污剔除血管脂肪等非心肌组织，经结扎点位置横断切除心房及结扎点以上部分心室，乌氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)包埋，立刻行快速冰冻切片机连续横轴切片，片厚6 μm，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，直接荧光显微镜下观察。每个心脏标本至少各挑选具有一定间隔的切片3张，每张切片挑选I/R边缘区4个视野，计数CM-Dil及DAPI双标记的细胞数量。

1.11心超评估心功能术后4 w，在彩色多普勒超声仪(GE公司超声工作系统，15 MHz探头)上进行大鼠心功能测定，于胸骨旁连续至少记录3个左心室长轴和短轴，记录测得的左心室射血分数(EF%)和左心室短轴缩短率(FS%)。

1.12氯化三苯基四氮唑(TTC)法计算心肌梗死面积检测超声心动图后，按上述同样方法处死动物。将心脏标本于-80℃冷冻30 min后沿左室长轴将左室横切为厚约2 mm的薄片，称重后将其置于30 ml 1%TTC溶液中，37℃水浴30 min。10%甲醛中浸泡过夜。根据不同的颜色将坏死心肌与存活心肌分离，分别称重。以坏死心肌重量与左室心肌重量百分比表示心肌梗死面积。

1.13Western印迹检测Bcl-2、Bax蛋白的表达100 mg邻近移植位点的冰冻心脏组织置于裂解缓冲液中匀浆。裂解心肌组织获取蛋白后，用二喹啉甲酸(BCA)比色法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，煮沸变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次，再分别加入二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，增强化学发光法(ECL)发光，凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)内保存图片，并用图像分析软件对条带进行灰度分析。

2结果

2.1体外TMZ预处理对BMSCs活性的影响心肌细胞经H/R处理后，其上清液中LDH、MDA活性显著升高〔(18.17±2.36)U/L vs (79.35±4.11)U/L，(3.80±0.81)nmol/ml vs (8.58±1.10)nmol/ml，P<0.05〕，SOD活性显著降低〔(13.88±1.82)U/ml vs (5.15±1.26)U/ml，P<0.05〕。BMSCs与H/R上清液共培养后，采用CCK-8法检测结果表明细胞活性均显著下降，但TMZ预处理后使其下降趋势得到明显逆转(56.66%±4.41% vs 78.54%±4.34%，P<0.05)。

2.2TMZ预处理对凋亡相关基因的作用与未预处理BMSCs相比，在TMZ预处理BMSCs中，抗凋亡基因Bcl-2表达上调(0.978 4±0.068 42 vs 2.891 2±0.182 48)，而促凋亡基因Bax表达下调(1.061 8±0.086 28 vs 0.318 5±0.035 49)(P<0.05)。

2.3各组大鼠血清中LDH、SOD及MDA的含量比较与Sham组相比，再灌注后3 h其余各组LDH、MDA活性均显著升高(P<0.05)，SOD活性均显著降低(P<0.05)，三组组间两两比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1　再灌注3 h后各组LDH、MDA及SOD活性的

与Sham组比较：1)P<0.05

2.4移植BMSCs存活数在荧光显微镜不同波长下采集到的图像利用计算机软件合并，可见双标记移植细胞，BMSCs+TMZ组每个高倍镜下双标记细胞数显著高于BMSCs组(9.17±3.40 vs 4.73±2.72，P<0.05)。见图1。

CM-DiI：呈红色荧光，标记细胞膜；DAPI：呈蓝色荧光，标记细胞核；Merge：为复合图 图1　两组移植细胞的存活数量比较(×200)

2.5心功能和梗死面积比较超声心动图结果显示Sham组、I/R组、BMSCs组、BMSCs+TMZ组的EF值分别为(78.1±3.6)%、(54.7±2.3)%、(63.1±2.0)%及(70.7±2.8)%，BMSCs组、BMSCs+ TMZ组EF值高于I/R组(P<0.05)。四组的FS值分别为(38.8±2.8)%、(26.2±1.5)%、(31.0±2.7)%及(35.2±1.7)%，BMSCs组、BMSCs+ TMZ组FS值高于I/R组(P<0.05)。后三组的梗死面积分别为(31.2±3.2)%、(22.8±2.2)%和(17.0±1.5)%，与I/R组相比，BMSCs组、BMSCs+ TMZ组的心肌梗死面积显著缩小(P<0.05)，BMSCs+ TMZ组的心肌梗死面积比BMSCs组进一步缩小(P<0.05)。

2.6TMZ预处理对凋亡相关蛋白的作用与BMSCs组比较，BMSCs+TMZ组的Bcl-2表达显著上调，而Bax表达显著下调(P<0.05)。见图2。

图2　各组Bcl-2与Bax的蛋白表达

3讨论

当发生急性心肌梗死AMI时，传统的治疗方法可选用溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗或急诊冠脉旁路移植术，使病变血管支配的梗死区域尽早得到血液供应，梗死面积减至最小，从而改善临床预后。研究证实，组织缺血缺氧性损伤不但发生于缺血时，更主要发生于恢复血液灌注后，其部分机制与自由基清除酶系活性降低、自由基含量增多有关。SOD是体内清除自由基的一类酶，其活性降低可使脂质代谢产物MDA水平升高，MDA可造成细胞损伤，是再灌注损伤的重要机制之一。SOD和MDA可反映机体清除氧自由基的能力〔5〕。LDH是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外，通过检测细胞培养上清液中LDH的活性，可判断细胞受损的程度。

从理论上讲，开通已闭塞的冠脉后改善了心肌局部的血液供应，使移植细胞生存的微环境得到改善，有利于细胞存活，但即刻也造成再灌注损伤，不利于细胞存活。Yang等〔6〕表明，大多数植入的BMSCs无法在梗死后心肌存活，心脏急性I/R的局部微环境不适合干细胞生存，使得AMI再灌注后细胞直接移植的心脏功能和形态无显著改善。细胞凋亡，氧化应激和强烈的炎症反应是已知的造成供体细胞死亡的不利因素。本研究的体外部分及体内研究部分，均证实I/R产生的严重细胞毒性和氧化应激对BMSCs存活十分不利，这与上述研究观点一致。

由于移植后的干细胞存活率低，使其治疗受到限制。除了移植的时间和途径影响外，急性期的细胞死亡被认为是制约BMSCs保护作用的主要因素〔2〕。基因修饰和BMSCs的预处理策略是流行和有效的促进BMSCs存活及功能恢复的方法。由于目前尚不清楚永久性基因修饰导致长期的基因和蛋白表达是否会导致肿瘤等副作用，从而限制了干细胞移植的临床应用。与此相反，预处理由于能够快速、简单、有效地提高干细胞移植效率，可能符合上述要求。干细胞的药物预处理成为提高移植细胞存活和功能恢复的一种新方法〔7〕。本研究根据Wisel等〔8〕有关TMZ和H2O2在治疗期间的最佳剂量与剂量/时间研究，确定TMZ预处理BMSCs的药物浓度为10 μmol/L，药物预处理时间为6 h。

细胞的凋亡过程受促凋亡基因和抑制凋亡基因双重调控，两者的平衡对维持细胞的功能非常重要。Bca-2基因是一个重要的凋亡抑制基因，Bax与Bcl-2的作用相反，Bcl-2/Bax比值决定细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡〔9〕。Bcl-2/Bax比值增加，细胞趋于存活；比值下降，细胞趋于凋亡。本研究结果表明，在体外共培养各组中，TMZ预处理可使细胞的活力下降趋势获得明显逆转；上调Bcl-2水平，下调Bax水平。总之，TMZ预处理BMSCs增强了移植细胞在恶劣环境中的抗凋亡能力，从而有利于移植细胞功能发挥，使其在心功能的恢复上获得了更进一步的改善。

4参考文献

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8Wisel S，Khan M，Kuppusamy ML，etal.Pharmacological preconditioning of mesenchymal stem cells with trimetazidine (1-〔2，3，4-trimethoxybenzyl〕piperazine)protects hypoxic cells against oxidative stress and enhances recovery of myocardial function in infarcted heart through Bcl-2 expression〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2009;329(2)：543-50.

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〔2014-06-13修回〕

(编辑袁左鸣)