老年冠心病人群的FVLeiden基因突变

老年冠心病人群的FVLeiden基因突变

张静翟丽杰

(吉林大学第二医院药品管理部，吉林长春130041)

摘要〔〕目的探讨老年冠心病人群凝血因子V(FV)Leiden突变的发生率。方法应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对167例老年冠心病人群(其中28例蒙古族，29例回族和110例汉族)和69例汉族健康人群进行FVLeiden基因突变研究分析。结果该老年冠心病人群和健康人群个体均未检出FVLeiden基因突变类型，包括纯合子和杂合子。结论老年冠心病人群中，蒙古族、回族、汉族冠心病患者和健康人群均未见到FVLeiden基因突变，提示FVLeiden突变可能不是冠心病形成的主要危险因素。

关键词〔〕冠心病；基因突变；凝血因子

中图分类号〔〕R541〔文献标识码〕A〔

通讯作者：翟丽杰(1973-)，女，主管药师，硕士，主要从事药理学研究。

第一作者：张静(1975-)，女，副主任药师，硕士，主要从事药理学研究。

研究〔1〕发现深静脉血栓患者中约20%～60%的血栓发生机制与活化蛋白C抵抗(APC-R)相关，其中凝血因子V(FV)Leiden基因1691A→G突变是APC-R的主要原因之一〔2〕。研究〔5〕表明，FVLeiden基因突变存在着世界性的地理异质性和种族差异性。冠心病、高血压患者处于一定的血栓前状态，与FVLeiden基因突变是否有密切关系目前还未见报道。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，对老年冠心病人群和健康人群的FVLeiden基因型频率和基因频率进行研究，为进一步研究其与中国老年冠心病人群的相关性提供理论依据。

1对象与方法

1.1研究对象167例均无血缘关系的老年冠心病患者，年龄65～70岁，男74例，女71例；28例蒙古族，29例回族，110例汉族。随机抽取69例无血缘关系的汉族健康人群作为对照组。

1.2仪器与试剂PCR仪，S1000型，美国Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统，Gel Doc XR型，美国Bio-Rad公司；台式低温离心机Sigma3K30型，德国Sigma公司；血液基因组提取试剂盒(9450)，TaKaRa Premix TaqTM酶及HindⅢ内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3FVL基因突变检测

1.3.1血液核酸提取全部研究对象抽外周静脉血1 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管内，充分混匀后放入-20℃冰箱中保存待检。取冷冻保存的抗凝全血100 μl于1.5 ml离心管中，按试剂盒说明进行核酸提取。

1.3.2PCR扩增引物根据文献〔4〕由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列：正义：5′-TCAGGCAGGAACAACACCAT-3′，反义：5′-GGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTA AAGCT-3′。PCR扩增反应体系为25 μl，其中DNA模板1 μl，2×mix 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，补充ddH2O至25 μl。PCR扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共30个循环，最后72℃ 延伸5 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，并置凝胶成像仪上观察特异性条带，正常PCR扩增产物大小为241 bp，并记录实验结果。

1.3.3PCR-RFLP分析取上述成功扩增的PCR产物10 μl，10倍缓冲液：2 μl，Hind Ⅲ限制性核酸内切酶1 μl，反应总体积20 μl，37℃酶切30 min后终止。用2%琼脂糖凝胶进行电泳，并于凝胶成像仪下观察酶切结果。

2结果

正常情况下241 bp的PCR扩增片段中不存在Hind Ⅲ内切酶的酶切位点，即野生型。若FVL基因发生A→G突变，则出现一个Hind Ⅲ内切酶酶切位点，其中241 bp片段被切成209 bp、32 bp 2个片段。若为突变纯合子，酶切后出现209 bp、32 bp二条电泳条带；若为突变杂合子，酶切后出现241 bp、209 bp、32 bp三条电泳条带。本实验167例冠心病患者人群中FVLeiden基因均无该突变类型，均为野生型，其PCR产物和酶切后的产物大小均为241 bp，不存在Hind Ⅲ内切酶的酶切位点。见图1。

同样，对健康人群的PCR产物以及经Hind Ⅲ限制性核酸内切酶酶切后的电泳图表明69例健康人群的FVLeiden也未发生突变，同老年冠心病人群没有差异。见图2。

老年冠心病人群FVLeiden基因突变的发生率也为0%，均为野生型，与汉族健康人群的FVLeiden基因无明显差异。

1～5：老年冠心病人群PCR 扩增产物；6～10：老年冠心病人群PCR酶切产物；M为标准分子量Marker 图1　老年冠心病人群PCR产物及Hind Ⅲ内切酶酶切 凝胶电泳

1～5：健康人群PCR 扩增产物；6～10：健康人群PCR酶切产物；M为标准分子量Marker 图2　健康人群PCR产物及Hind Ⅲ内切酶酶切 凝胶电泳

3讨论

关于FVLeiden基因突变的报道很多，由于研究方法的差异和样本含量不同等原因，结果也不尽相同。Bertina等〔5〕发现，64例有APC-R现象的血栓形成患者中，56例携带有FVLeiden突变的等位基因。在60岁以上有冠心病史的男性患者中，该等位基因的检出率为25.8% 。随后，他们在对77例冠心病患者的随访调查中发现，携带者复发的可能性比未携带者多2～3倍。

高丽霞等〔6〕认为APC-R现象在新疆地区少数民族健康者中中有较高的发生率，其分布与人种、地域有关。本研究结果提示FVLeiden突变可能不是我国健康人群以及冠心病患者发病的主要危险因素。

4参考文献

1Dahlback B，Carlsson M，Svensson PJ.Familial thrombophilia due to a previously uncognised mechanism characterized by poor anticoagulantresponse to activated protein C：prediction of a cofactor to activated protein〔J〕.Proc Nat Acad Sci，1993；90(3)：1004-8.

2Bertina RM，Koeleman PC，Koster T，etal.Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C〔J〕.Nature，1994；369(6475)：64-7.

3王秉林，戈小虎.FV Leiden 与FⅡG20210A 突变在不同种族人群易栓症中表达的研究现状〔J〕.中国普外基础与临床杂志，2012；19(7)：793-5.

4Huber S，McMaster KJ，Voelkerding KV.Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V leiden and prothrombin G20210A〔J〕.J Mol Diagn，2000；2(3)：153-7.

5Bertina RM.Factor V.Leiden and other coagulation factor mutations affecting thrombotic risk〔J〕.Clin Chem，1997；43(9)：1678-83.

6高丽霞，哈力达·亚森，许风雷，等.新疆地区动脉血栓形成患者抗活化蛋白C及FVLeiden 突变的调查〔J〕.血栓与止血学，2007；13(4)：161-3.

〔2013-11-21修回〕

(编辑袁左鸣)