对氧磷酶1Q192R基因多态性与2型糖尿病合并牙周病的相关性

对氧磷酶1 Q192R基因多态性与2型糖尿病合并牙周病的相关性

杜蔚莲宋莉戴芳朱德星

(南昌大学第二附属医院口腔科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探讨江西汉族人群对氧磷酶1(PON1)Q192R基因多态性与2型糖尿病(T2DM)合并牙周病的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)和DNA直接测序技术，检测64例正常人(N组)、61例单纯T2DM(DM组)患者、64例T2DM合并牙周病患者(DM+P组)PON1 Q192R基因型。分析江西地区汉族人群PON1 Q192R基因型和等位基因的分布特点，以及T2DM和T2DM合并牙周病的危险因素。结果①3组间临床资料比较：与N组比较，DM、DM+P组研究对象的平均年龄均显著偏高；DM组的体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、收缩压(SBP)平均水平高于N组，而高密度脂蛋白(HDL)平均水平低于N组；DM+P组的TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N组，而HDL平均水平低于N组(P<0.05)。与DM组相比，DM+P组平均年龄约高7岁，SBP平均水平和吸烟率均高于DM组(P<0.05)。②3组内不同性别临床资料比较：N组女性的TG平均水平和吸烟率低于男性(P<0.05)；DM组女性的HDL平均水平高于男性，而吸烟率低于男性(P<0.05)；DM+P组女性的BMI、HbA1c平均水平均低于男性(P<0.05)。③PON1 Q192R基因多态性TT、CC、TC基因型频率和T、C等位基因频率在3组之间两两比较，P值均>0.05。④在N组和DM组的二分类Logistic回归分析中，年龄、TG、TCH、SBP的OR值均>1，为发生DM的独立危险因素；在DM组和DM+P组的二分类Logistic回归分析中，年龄、SBP和BMI的OR值均>1，而BMI的OR值<1，提示年龄和SBP是发生T2DM合并牙周病的独立危险因素，而BMI则有保护作用(以α=0.05为纳入标准，以α=0.1为剔除标准)。结论①在其他因素存在的情况下，PON1 Q192R基因多态性不能作为T2DM合并牙周病的独立危险因素。②高年龄、高TG、高TC、高SBP是T2DM的独立危险因素；高年龄、高SBP是T2DM合并牙周病的独立危险因素，而BMI则是保护因素。

关键词〔〕对氧磷酶1；基因多态性；糖尿病；牙周病

中图分类号〔〕R587〔文献标识码〕A〔

通讯作者：宋莉(1969-)，女，硕士生导师，主要从事牙周病与全身性疾病关系的研究。

第一作者：杜蔚莲(1987-)，女，住院医师，硕士，主要从事牙周病与全身性疾病关系的研究。

牙周病属于口腔感染性疾病，是糖尿病(DM)的并发症之一〔1〕，其发生是遗传因素和环境因素等多因素共同作用的结果。DM和牙周病互相影响、互为因果〔2〕。目前认为，氧化应激与DM关系非常密切，氧化应激不仅在DM的发生发展过程中起到了重要作用，还可以引起DM其他大血管、微血管并发症〔3,4〕。对氧磷酶(PON)是重要的抗氧化剂酶，是内源性自由基清除剂，在氧化应激中起重要作用。近年来，Altuner等〔5〕,Ergun等〔6〕通过实验得出结论，PON1活性及其Q192R与M55L的基因多态性与DM及其并发症相关，且Q192R多态性相关性更大。由于基因具有种属差异性等等原因，国内外研究结果存在争议。其中有关中国人PON1基因Q192R多态性与DM合并牙周病的相关性研究尚未见报道。本研究旨在应用分子生物学技术探讨PON1基因Q192R多态性与2型DM(T2DM)合并牙周炎的关系。

1材料与方法

1.1研究对象随机选取我国江西地区汉族人189例，其中男92例，女97例。年龄24~82〔平均(51.59±16.14)〕岁。其中正常对照组(N组)64例(DNA组)、单纯T2DM组(DM组) 61例、T2DM合并牙周病组(DM+P组) 64例。

1.2入选标准所有研究对象3个月内均未使用抗生素，1年内未接受牙周治疗，全口至少有16颗可以进行牙周评价的牙齿，至少有4颗磨牙，妇女无妊娠，均为长期居住在江西地区的汉族人口，且受试者在试验前均签署知情同意书。

1.2.1N组纳入标准选取在南昌大学第二附属医院体检科经相关检查除外DM病、牙周病、冠心病及其他代谢相关疾病的表观健康人64例(N组)，其中男28例，女36例，年龄24~78〔平均(37.66±14.49)〕岁。受试者全口牙的PD≤3 mm,平均CAL≤0.5 mm，无邻面部位CAL≥3 mm，缺失牙不超过2颗，没有任何冠状动脉疾病、高血压、脂代谢紊乱及家族DM、心血管疾病史。

1.2.2DM组纳入标准选取南昌大学第二附属医院内分泌科于2010年11月至2011年11月之间新近诊断T2DM的患者61例(DM组)，其中男28例，女33例，年龄26~79〔平均(54.86±12.68)〕岁。诊断标准符合1999年世界卫生组织(WHO)诊断标准〔7〕：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)糖耐量试验2 h血糖(OGT 2 h PG)≥11.1 mmol/L。排除标准：①有其他严重全身性疾病及DM并发症；②有呼吸、消化、泌尿、生殖系统或身体其他部位的炎症感染；③牙周病患者；④全身状况较差，不能配合临床口腔状况检查者；⑤近期糖尿病状况及用药量有明显变化；⑥非T2DM者。

1.2.3DM+P组纳入标准选择2010年11月至2011年11月在南昌大学第二附属医院内分泌科因DM住院的患者64例(DM+P组)，男36例，女28例，年龄40~82〔平均(62.39±9.41)岁〕。受试者患有T2DM的同时有明显的菌斑、牙石及局部刺激因素，且与牙周组织的炎症和破坏程度一致，病情进展缓慢，也可间有快速进展的活动期；无明显错合畸形或不良修复体等局部刺激因素，不吸烟，排除侵袭性牙周炎。根据受试者牙周炎程度，选择中重度牙周炎患者，参照Armitage等〔8〕推荐的诊断标准，口内平均(AL)≥1.6 mm，至少3个区或至少6颗牙的邻面部位AL≥3 mm，缺失牙数4~14颗(第3磨牙拔除、正畸牙拔除、外伤脱落牙、大面积龋失牙及先天缺牙除外)。

1.3主要仪器和试剂电泳仪、PCR仪、全自动凝胶成像分析系统、电热恒温水浴箱、漩涡振荡器、台式大容量高速离心机、超纯水系统、微量分光光度计。血液基因组小量提取试剂盒、溴乙啶(EB)(10 mg/ml)、Biowest琼脂糖、TaqDNA聚合酶2xMaster Mix、DM2000Ladder marker、Tris、冰醋酸、EDTA、无水乙醇。引物序列如下：正义引物5′-TATTGTTGCTGTGGGACCTG-3′反义引物5′-AGAGTTCACATACTTGCCATCG-3′(由南京金斯瑞生物科技公司合成)。

1.4研究方法

1.4.1样本一般特征及临床资料收集每位研究对象的详细临床资料，包括：性别、年龄、民族、出生地、体重指数(BMI)、心率(HR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、FPG、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、糖化血红蛋白(HbA1c)、吸烟与否。

1.4.2DNA的提取取受试者前臂静脉血2 ml，-70℃保存。采用DNA提取试剂盒提取外周血总基因组DNA，-20℃保存。

1.4.3DNA纯度鉴定及含量的测定提取的DNA溶液用NanoPhotometer Pearl微量分光光度计在260 nm、280 nm处测量其吸光度，记录A260/A280比值和DNA浓度。经微量分光光度计检测，若A260/A280值在1.8左右，说明提取的基因组DNA纯度较高。

1.4.4PCR扩增反应总体系为50 μl，包括：SinoBio2×MasterMix25 μl,10 μmol/L上下游引物各1 μl,10 ng/μl DNA模板2.5 μl，加ddH2O至50 μl。经梯度PCR仪进行退火温度梯度扩增，寻找最佳反应条件，终设定退火温度为61℃。

1.4.5琼脂糖凝胶电泳取PCR产物5 μl，用1.5%琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳，全自动凝胶成像分析系统观察结果。

1.4.6PCR产物纯化及序列测定PCR产物的纯化和序列由南京金斯瑞公司完成。测序结果经Chromas软件读取分析。

1.5统计学分析基因型和等位基因及其频率的Hardy-Weinberg平衡检验采用HaploviewVersion 4.2软件进行分析。采用Excel2007和SPSS18.0软件进行t检验、方差分析、χ2检验，相关疾病危险因素分析采用二分类Logistic回归分析，计算其相对风险度比值比(OR)及95%可信区间(CI)。

2结果

2.1PON1 Q192R多态性基因型判定PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后紫外灯投照下观察结果，可见片段长度为205 bp的条带，见图1。PCR产物的纯化和序列测序由南京金斯瑞公司完成。测序结果经Chromas软件读取分析，测序结果如图2。

M为DM2000 Ladder marker，1~6：PCR产物，7为阴性对照 图1　PCR产物电泳结果

图2　PON1 Q192R基因多态性PCR产物测序结果

2.2不同组间一般临床资料比较3组研究对象之间的临床资料比较见表1。DM、DM+P组研究对象的平均年龄均显著高于N组，DM组的BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N组，而HDL平均水平低于N组；DM+P组的TC、TG、FPG、HbA1c、SBP平均水平高于N组，而HDL平均水平低于N组(P<0.05)。DM+P组与DM组相比，平均年龄约高7岁,SBP平均水平和吸烟率高于DM组(P<0.05)。

2.3不同组PON1 Q192R基因多态性频数分布比较经Haploview软件分析，不同组人群PON1 Q192R均符合基因多态性分布情况Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。N组、DM组、DM+P组都以TC基因型为主，等位基因频率都以C为主。PON1 Q192R基因多态性的3种基因型分布在N组与DM组之间(χ2=0.622，P=0.733)，N组与DM+P组之间(χ2=1.633，P=0.442)及DM与DM+P组之间比较均无统计学差异(χ2=3.219，P=0.200)。见表2。

表1　各组研究对象一般情况比较 ± s)

与N组比较：1)P<0.05，与DM组比较：2)P<0.05

表2　各组PON1 Q192R基因多态性基因型分布和

2.4DM合并牙周病危险因素的二分类Logistic回归分析将N组和DM组研究对象进行二分类Logistic回归分析，将是否患有DM作为因变量Y(0=否，1=是)，其他各项指标作为自变量(X)，分析结果如下：高年龄、高TG、高TC、高SBP是本组研究对象发生DM的独立危险因素。见表3。将DM组和DM+P组研究对象进行二分类Logistic回归分析，将是否患有DM合并牙周病作为因变量Y(0=否，1=是)，其他各项指标作为自变量(X)，分析结果如下：高年龄、高SBP是本研究对象发生DM合并牙周病的独立危险因素，而BMI则有保护作用。见表4。

表3　DM危险因素二分类Logistic回归分析

表4　DM合并牙周病危险因素二分类Logistic回归分析

3讨论

PON是重要的抗氧化剂酶，具有抗氧化能力，能够清除体内过多的氧自由基，维持体内氧化还原的动态平衡，在氧化应激中起重要作用。许多研究认为PON活性降低是导致DM慢性并发症(DCC)的主要原因之一。国外有研究表明PON1 Q192R与L55M的多态性与DM及其并发症相关，且PON1 Q192R多态性相关性更大〔9〕。

在PON1 编码区的2个多态性位点Q192R和M55L中， Q55L由于跟PON1启动子区相关联，其多态性主要决定了PON1的浓度〔10〕，而Q192R在很大程度上影响着PON1的活性〔11,12〕。PON1 Q192R多态性、基因环境和(或)基因相互作用，三者决定了不同人群不同个体血清中PON1的活性的不同〔13〕。具有较高氧化应激风险的DM患者，具有更高的血管性疾病及其他并发症的并发率。在DM患者中有过多的氧化产物可能是由于慢性高血糖，高胰岛素血症，升高游离脂肪酸(FFA)和血脂异常〔14〕，其活性的降低不是由于合成减少，而是由于PON1蛋白的糖基化〔15〕。Mackness等〔16〕指出PON1活性降低以及PON1R和L位点的基因多态性与T2DM发生有直接的关系。Altuner等〔5〕通过实验得出结论，PON1 Q192R与Q55L的多态性与糖尿病及其并发症相关，且与Q192R多态性相关性更大。目前为止，尚未见报道PON1 Q192R基因多态性与DM合并牙周病的关系。本次研究评价了江西地区汉族人群PON1 Q192R基因多态性与DM合并牙周病的关系，未发现二者之间存在明显的关联性。

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〔2013-11-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)