黄芪甲苷灌胃预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

黄芪甲苷灌胃预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

马小亮王桂敏1

(辽宁医学院研究生院，辽宁锦州121001)

摘要〔〕目的探讨黄芪甲苷灌胃预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(I/R)的保护作用。方法将100只大鼠随机分为三组，最终90只大鼠造模成功，其中假手术组29只，模型组30只，干预组31只。假手术组与模型组给予普通饲养+生理盐水(2 ml·kg-1·d-1)灌胃，干预组给予普通饲养+黄芪甲苷(10 mg·kg-1·d-1)灌胃。造模时，假手术组大鼠只在冠状动脉左室支左心耳下缘约0.5 cm处穿线，不结扎；模型组及干预组大鼠给予结扎。于灌注24 h后采用TUNEL法计算细胞凋亡指数(AI)，比较Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表达。结果三组间AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白比较差异表达(均P<0.05)，进一步两两比较，模型组及干预组的AI、Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表达显著高于假手术组，模型组的AI、Bax、caspase-3蛋白表达显著高于干预组，Bcl-2蛋白表达显著低于干预组(均P<0.05)。结论在大鼠心肌缺血再灌注过程中存在明显的细胞凋亡过程，在此过程中，黄芪甲苷可能通过上调Bcl-2的表达、降低Bax的表达实现其对心肌细胞的保护作用。

关键词〔〕心肌缺血；再灌注损伤

中图分类号〔〕R54〔文献标识码〕A〔

通讯作者：王桂敏(1957-)，女，硕士，主任医师，主要从事中西医结合治疗心脑血管及老年病方面的研究。

1辽宁医学院附属第一医院中医科

第一作者：马小亮(1984-)，男，硕士，医师，主要从事中西医结合治疗心脑血管及老年病方面的研究。

在心肌缺血的心肌细胞中，即使重新恢复血流供应，也可能会发生心肌细胞超微结构、代谢功能以及电生理方面的损害，这种损害甚至是无法逆转的，这种现象被称为“心肌缺血再灌注损伤”(I/R)〔1～3〕。因此，如何减轻或者逆转这种损伤成为临床上的研究重点。大量研究表明黄芪具有显著的心肌保护作用，而黄芪甲苷作为黄芪中的中药活性成分，是否也具有相同的功效，其中的生理机制又是如何？本文通过观察大鼠心功能以及心肌细胞中Bax、Bcl-2以及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的改变，旨在探讨黄芪甲苷对心肌细胞的保护作用及其机制。

1材料与方法

1.1动物选用清洁级雄性Wistar大鼠100只，体重240～360 g，由南京君科生物工程有限公司提供，实验动物使用许可证号：XYDS(沪)2013-0025。

1.2材料和试剂黄芪甲苷由上海锐谷生物科技有限公司提供，生产批号：HWJG 2013025。兔抗人Bcl-2多克隆抗体、兔抗人Bax、 Bcl-2以及caspase-3多克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、免疫组化试剂盒、原位末端转移酶标记法(TUNEL)凋亡试剂盒由武汉博士德生物有限公司提供。

1.3分组适应性喂养1 w后，随机分为三组，假手术组33只，给予普通饲养生理盐水2 ml·kg-1·d-1灌胃，2 w后仅在冠状动脉左室支左心耳下缘进行穿线处理，但不结扎，未造成心肌缺血；模型组34只，普通饲养2 w生理盐水2 ml·kg-1·d-1灌胃后，大鼠建立心肌I/R模型；干预组33只，大鼠在心肌I/R模型建立前，给予普通饲养的同时，进行黄芪甲苷10 mg·kg-1·d-1灌胃2 w。

1.4大鼠I/R模型制备大鼠心肌I/R模型建立步骤：①麻醉：以5 ml/kg为标准，用10%的水合氯醛进行腹腔注射；②插管保持呼吸通畅；③动脉插管监测心率及平均动脉压；④在冠状动脉左室支左心耳下缘0.5 cm处进行穿线结扎；⑤阻断灌状血流10 min，将结扎线解开再灌注1 h。模型复制以六导心电图进行评判，评判标准如下：①ST端抬高0.5 mV；②结扎处松开后，ST段下降1/2以上， R波振幅降低；③可见有心律失常或Q波，其中①、②为必要条件。在模型建立时，假手术组有4只大鼠在手术过程中出现呼吸道阻塞死亡，模型组大鼠有4只大鼠模型建立失败，干预组有2只大鼠出现心脏骤停死亡，建模成功率为90%。

1.5心肌凋亡情况测定①将取得的心肌组织于4%的多聚甲醛中固定、脱水、浸蜡包埋；②切片并脱蜡；③磷酸盐缓冲液洗涤；④加50 μl TUNEL检测液；⑤30℃下避光孵育1 h；⑥磷酸盐再次冲洗；⑦荧光显微镜下计数。凋亡指数(AI)计算公式：阳性细胞/总细胞数×100%。

1.6Bax、Bcl-2以及caspase-3测定采用免疫组织化学SP法：①将相应的石蜡切片脱蜡；②室温下，3%的过氧化氢灭活内源性酶；③微波修复抗原；④苏木精复染，脱水后封片镜检。以正常兔IgG代替一抗做对照。使用ImagePro Plus Analysis Software 6.0软件在200倍显微镜下测量其吸光度，每张切片取5个视野，计算平均吸光度。

1.7统计学方法应用SPSS16.0进行正态性及方差齐性检验；单因素方差分析和LSD检验。

2结果

2.1各组大鼠心肌细胞凋亡结果比较于灌注24 h后，用TUNEL法对大鼠心肌细胞凋亡情况进行测定，蓝色为正常细胞显示内容，棕色为阳性细胞细胞核显示内容(如图1)。将结果输入图像分析软件，结果发现三组AI值有显著性差异(F=12.562，P<0.05)。两两比较，模型组AI值〔(10.25±2.65)%〕显著高于干预组〔(8.01±1.66)%〕及假手术组〔(5.31±1.23)%〕，干预组显著高于假手术组(均P<0.05)。

图1　心肌凋亡图(×200)

2.2各组大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3平均吸光度比较三组间心肌组织中的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白表达具有显著性差异(F=19.56、21.02、16.98，均P<0.05)；两两比较，模型组及干预组的Bax、Bcl-2以及caspase-3蛋白的表达显著高于假手术组，模型组的Bax、caspase-3蛋白显著高于干预组(P<0.05)，模型组Bcl-2蛋白显著低于干预组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠Bax、Bcl-2以及caspase-3

与假手术组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05

3讨论

黄芪甲苷是中药黄芪中的主要活性物质之一，为皂苷类化合物。研究显示，这种黄芪中的主要成分对缺血性再灌注损伤的心肌细胞具有较为显著的保护作用〔4〕。然而其中的具体机制目前尚未明确。

心肌细胞的死亡方式主要为坏死和细胞凋亡，所以I/R所导致的心肌细胞凋亡也在此列。然而细胞凋亡是一个复杂的过程，其中多个基因参与到此过程中，其中最受关注的就是Bcl-2家族，而Bax和Bcl-2作为家族中的主要成员，Bcl-2主要的生理功能是抑制细胞凋亡，延长细胞寿命〔5〕。Bax的功能正好与此相反，具有促进细胞凋亡的作用，两者可在细胞内形成异源二聚体——Bax-Bcl-2，异源Bax-Bcl-2较为稳定，无诱导凋亡作用，而当Bax较Bcl-2升高时，则合成同源Bax-Bcl-2，可诱导凋亡〔6〕。caspase-3作为caspase家族中的一员，同样在细胞凋亡过程中扮演重要角色，其诱导过程为蛋白酶级联反应，首先激活caspase，然后逐级活化细胞凋亡蛋白，最后激活执行型caspase，最终作用于底物蛋白，使蛋白分解导致细胞凋亡〔7，8〕。

本研究结果提示黄芪甲苷对大鼠I/R的保护作用比较明显；另外提示在I/R大鼠心肌细胞中存在较多的细胞凋亡和抗凋亡诱导因子，而黄芪甲苷对心肌细胞的保护作用可能同上调Bcl-2的表达、同时降低Bax的表达来实现。但本研究尚处于初级阶段，尚需更加深入系统的研究。

4参考文献

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4Zhang WD,Chen H,Zhang C,etal.Astragaloside Ⅳ from Astragalus membranaceus shows cardioprotection during myocardial ischemia in vivo and in vitro〔J〕.Planta Med,2006;72(1):4-8.

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7Doonan F,Cotter TG.Detection of DNA fragmentation inretinal apoptosis by TUNEL〔J〕.Methods Mol Biol,2013;935(2):207-13.

8Brot S,Rogemond V,Perrot V,etal.CRMP5 interacts with tubulin toinhibit neurite outgrowth,therebv modulating the function of CRMP2〔J〕.J Neurosci,2010;30(32):10639-54.

〔2015-04-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)