同源异型盒基因在胶质瘤细胞增殖及迁移侵袭中的作用

同源异型盒基因在胶质瘤细胞增殖及迁移侵袭中的作用

刘鹏冉雯雯1吴泽玉2伦鹏2孟庆海1

(青岛市黄岛区第二人民医院，山东青岛266400)

摘要〔〕目的研究同源异型盒基因(HOXA5)在胶质瘤增殖及迁移侵袭中的作用。方法采用shRNA干扰技术构建HOXA5低表达胶质瘤细胞系，通过MTT，Transwell和Matrigel方法研究干扰HOXA5表达后对胶质瘤细胞增殖和侵袭迁移的影响。结果与对照组细胞相比，干扰HOXA5表达后能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖和运动侵袭能力(P<0.01)。结论HOXA5可能在胶质瘤的发生发展中具有重要的作用，其机制与促进细胞的增殖和侵袭迁移有关。

关键词〔〕胶质瘤；同源异型盒基因A5；细胞增殖；细胞迁移

中图分类号〔〕R739.4〔文献标识码〕A〔

基金项目：青岛市医疗卫生优秀人才培养项目资助(2015)

通讯作者：孟庆海(1950-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事脑肿瘤的基础与临床研究。

1青岛大学医学院附属医院病理科

2青岛大学医学院附属医院神经外科

第一作者：刘鹏(1980-)，男，博士，主治医师，主要从事脑肿瘤的基础与临床研究。

肿瘤呈多因素诱导、多基因参与、多阶段发生的极其复杂的病理过程，癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是人类肿瘤形成和发展的物质基础〔1〕。肿瘤的发生似乎重现了胚胎早期发育及胚胎畸变的过程，调控细胞发育的重要转录因子，同源异型盒基因(HOXA5)就是其中具有代表性的一个。HOXA5基因的异常表达在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，其该作用可能通过参与细胞周期和(或)细胞凋亡调控而实现〔2～4〕。研究显示，在白血病、神经系统肿瘤、宫颈癌、结肠直肠癌等多种肿瘤中已检测到HOXA5的异常表达〔5～8〕。HOXA5的异常表达已被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关，但在胶质瘤中作用尚不清楚。本研究拟应用体外培养胶质瘤细胞系，通过RNA干扰技术研究HOXA5在胶质瘤中的作用及可能的分子机制。

1材料与方法

1.1细胞和抗体胶质瘤细胞系U87、U373、U251、T98G、SW1088购于武汉大学中国典型保藏中心，细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5% CO2，每2 d换液1次，细胞长至80%时进行传代及实验。HOXA5和β-acitn的抗体均购自CST。

1.2HOXA5干扰质粒及稳定转染干扰质粒细胞系的构建根据pSuper质粒说明书的要求，设计两个与HOXA5 mRNA配对的核苷酸序列，通过华大公司合成后，退火，克隆至pSuper质粒的相应位点，转化大肠杆菌，小提后测序验证分别命名为pSuper shHOXA5A和pSuper shHOXA5B。应用逆转录病毒包装细胞Phinex，包装逆转录病毒后感染U251细胞，经嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株，经Western印迹和RT-PCR检测对HOXA5干扰效果后应用于后续实验。

1.3RT-PCR常规按照Trizol试剂说明书提取细胞总的mRNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度后进行逆转录反应成cDNA。应用PCR试剂盒扩增检测HOXA5的表达，并用2.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.4Western印迹提取细胞裂解液，蛋白浓度测定后通过10% 的SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后封闭2 h，分别应用相应的一抗孵育过夜后，TBST洗3次，每次10 min，室温下加入相应二抗孵育1 h，洗涤后应用ECL化学发光反应，然后显影、定影。胶片扫描后应用凝胶图像处理系统分析条带的光密度值。

1.5激光共聚焦检测细胞免疫荧光染色细胞爬片后甲醛固定，3%H2O2孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，封闭后一抗4℃过夜，PBS冲洗后加入荧光标记的二抗室温孵育1 h，PBS冲洗后，DAPI复染细胞核，PBS冲洗后封片，Zeiss 7800激光共聚焦显微镜下观察荧光强度变化。

1.6MTT实验取对数生长期的对照组和实验组的细胞，用0.25%的胰酶常规消化，计数，用含有10%FBS的培养基调节细胞密度为2×104/ml，分别接种到96孔板中，100 μl/孔，每组设6个复孔；另外设置调零孔：含有10%FBS的培养基，100 μl/孔；将96孔板置于CO2培养箱，在37℃，5% CO2及饱和湿度环境下，分别培养1，2，3，4 d后，每孔加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h，终止培养；将上清去掉，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪上，OD值570nm处测量各孔的吸光值。

1.7细胞迁移与侵袭实验迁移实验：细胞培养至对数生长期，消化细胞，用D-Hanks和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105/ml；在Transwell的下室(即24孔板底部)加入800 μl含10%血清的培养基，上室加入100 μl细胞悬液，继续在孵箱培养48 h；用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800 μl甲醇的孔中，室温固定30 min；取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800 μl Giemsa染液的孔中，室温染色30 min；在清水浸泡数次，取出chamber，吸干上室液体，用湿棉棒小心擦拭上室底部膜表面上的细胞；小心地用镊子揭下膜，底面向上晾干，用中性树胶将膜封片在载玻片上；于光学显微镜下计数，统计结果。侵袭实验：在Transwell小室的上室底部中央垂直加入50 μl稀释后的Matrigel胶，其余操作过程同迁移实验。

1.8统计学方法应用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析及t检验。

2结果

2.1胶质瘤细胞中HOXA5的表达Western印迹检测发现，相对于大鼠的正常脑组织中的低表达状态，在5种胶质瘤细胞株中HOXA5的表达呈不同程度的高表达，其中恶性侵袭程度高的胶质瘤细胞U87和U251中表达显著增高。见图1。

2.2shRNA干扰HOXA5的U251细胞系的构建各种方法证实pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B在蛋白和mRNA水平分别不同程度地干扰掉HOXA5的表达。见图2。

2.3干扰HOXA5后U251细胞增殖能力降低MTT结果显示，相对于对照组细胞(pSuper)，shRNA干扰HOXA5表达后的U251细胞组(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)在48 h、72 h和96 h的细胞增殖能力显著降低，表明干扰HOXA5表达能够抑制胶质瘤细胞的增殖能力。见表1。

图1　Western印迹检测正常脑组织和胶质瘤细胞株中 HOXA5的表达

1：空载体；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 Western印迹检测

1：空载体；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 RT-PCR检测

免疫荧光染色

组别0p4p8h72h96h空载体0.31±0.050.43±0.070.61±0.090.71±0.060.84±0.07pSupershHOXA5A0.29±0.030.41±0.020.43±0.060.45±0.020.50±0.03pSupershHOXA5B0.32±0.060.38±0.050.42±0.070.47±0.030.51±0.02

2.4干扰HOXA5后U251细胞迁移和侵袭能力降低见图3。Transwell实验和Matrigel实验分别检测细胞的迁移和侵袭能力，结果表明：相对于对照组U251细胞(pSuper)迁移(53±4)和侵袭能力(37±6)，干扰HOXA5后的U251细胞(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)的迁移(19±3，22±3)和侵袭能力(17±2，19±3)均不同程度的降低(P<0.01)，表明干扰HOXA5能够抑制胶质瘤细胞的运动和侵袭能力。

图3　实验细胞的迁移和侵袭能力检测(200×)

3讨论

HOXA5基因的表达与肿瘤的相关性具有自身的特点：在组织器官正常发育与肿瘤的发生过程中HOXA5基因的表达不尽相同；HOXA5基因可能与家族成员之间可能存在一种协同调控的网络机制；HOXA5基因的表达与细胞因子、生长因子和激素之间存在相互作用；HOXA5基因可以影响正常细胞周期，参与细胞周期"检查点"的调控；此外HOXA5可能通过调节细胞凋亡而发挥作用〔9〕。本研究在体外初步研究了HOXA5在胶质瘤细胞的表达以及对胶质瘤细胞增殖和运动侵袭能力的影响，为深入研究HOXA5在胶质瘤发生发展中的作用和分子机制提供一定基础。在胶质瘤细胞系中HOXA5表达升高，表明HOXA5可能与胶质瘤具有一定的相关性，可能在胶质瘤的发生、发展中具有重要的作用。细胞增殖能力增强是恶性胶质瘤体积扩增的主要原因之一，本研究提示胶质瘤细胞中高表达的HOXA5可能具有促进胶质瘤细胞增殖的能力。胶质瘤的局部浸润和远处转移是其恶性程度的标志之一〔10〕，本研究表明高表达的HOXA5对胶质瘤细胞的运动和侵袭能力具重要的调控作用。

4参考文献

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10Thiery JP，Lim CT.Tumor dissemination：an EMT affair〔J〕.Cancer Cell，2013；23(3):272-3.

〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)