电针对血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能及海马神经细胞凋亡和突触素表达的影响

电针对血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能及海马神经细胞凋亡和突触素表达的影响

黄晓江蒋雯雯1贾丛林1胡荫1王欣1赵晶1韦登明1

(华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科，湖北武汉430030)

摘要〔〕目的观察电针对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆功能和海马神经细胞凋亡和神经突触素(Syp)表达的影响。方法SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、电针组，每组10只。在建立 VD 大鼠模型后，电针“百会”、“大椎”穴,每天1次，留针20 min，连续治疗10 d ，水迷宫观察大鼠学习记忆能力,TUNEL染色技术观察脑组织海马神经细胞凋亡结果，免疫组织化学染色技术观察脑组织海马神经细胞Syp表达。结果与模型组比较，经电针治疗后水迷宫潜伏期明显缩短(P<0.01),相同时间内在原平台象限跨越相应平台次数明显增多 (P<0.01)；海马TUNEL免疫阳性细胞积分光密度显著减少(P<0.05)，海马Syp免疫阳性细胞积分光密度显著增加(P<0.05)。结论电针大鼠“百会”、“大椎”穴能改善大鼠学习记忆能力,其机制可能与其抑制海马神经细胞凋亡和促进海马Syp表达有关。

关键词〔〕血管性痴呆；电针；学习记忆能力；凋亡；突触素

中图分类号〔〕R743〔文献标识码〕A〔

基金项目：浙江省自然科学

通讯作者：韦登明(1963-)，男，教授，硕士生导师，主要从事传统医药防治脑血管疾病的研究。

1宁波大学医学院病理教研室

第一作者：黄晓江(1978-)，男，副主任医师，硕士，主要从事脑血管病的防治研究。

海马是机体学习、记忆的主要功能脑区，脑缺血导致海马神经细胞出现凋亡〔1,2〕。针灸具有多环节作用的特点，可较好地防治血管性痴呆(VD)引起的损伤，改善学习、记忆功能〔3,4〕。研究表明〔3,4〕，电针大鼠百会、大椎穴能改善VD大鼠学习记忆能力，其机制可能与调节海马蛋白激酶C、谷氨酸及其受体的表达有关。而电针大鼠百会、大椎穴改善VD大鼠学习记忆能力与海马神经细胞凋亡及突触素(Syp)表达影响的关系如何，尚未见报道。本实验旨在探讨电针改善VD大鼠学习记忆及其与海马神经细胞凋亡和Syp表达影响的关系。

1材料与方法

1.1 动物及分组体重200～250 g SD健康大鼠由浙江省实验动物中心提供，合格证号0102008，雌、雄不限。按照动物饲养条例饲养。根据随机分组原则，分为假手术组、模型组、电针组,每组10只。

1.2 试剂仪器电针治疗仪(G6805-2B，上海华谊医用器械厂)；凋亡检测试剂盒、兔抗大鼠Syp多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；JD801形态学显微图像分析系统(江苏省捷达科技有限公司)；Morris水迷宫(北京新天地科技公司)。

1.3 模型制备分别对模型组和电针组进行造模手术，造模手术采用王蕊等〔5〕改进后的方法造模。用10% 的水合氯醛按照3 ml/kg的剂量腹腔注射麻醉实验大鼠，待实验大鼠安静后，腹腔注射(3.5 mg/kg体重)的硝普钠以达到低血压的目的，随即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭10 min再通10 min，再夹闭10 min，再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不阻断颈总动脉及注射硝普钠。

1.4 电针干预方法手术后观察手术切口基本愈合，饮食正常，于术后第7 d开始给予电针治疗。对电针治疗组进行为期10 d的电针治疗，将电针治疗组动物放入大鼠固定器中，待实验动物安静后，参照实验针灸学〔6〕中大鼠的穴位定位方法取百会、大椎穴，“百会” 穴在顶骨的正中，“大椎”穴在背部的正中的第7颈椎与第l胸椎之间，用28号30 mm长毫针，分别在“百会”“大椎”两处刺入1.5 mm，进行电针治疗，施以频率为50 Hz，强度约1 mA，以大鼠能耐受为度，每天电针治疗1次，留针约20 min，按照此方法持续治疗10 d。

1.5 学习记忆行为学检测采用Morris水迷宫试验〔7〕，于电针治疗结束时(即实验第17天)进行检测。①定位航行试验：历时6 d,每天2次,将大鼠固定从第一象限面向池壁放入水中，记录其2 min内寻找平台的时间，即逃避潜伏期(EL)。逃避潜伏期越短提示大鼠学习记忆能力越强，反之则越差。②空间探索试验：定位航行试验结束后(即实验第22天)撤除平台，将大鼠固定从第一象限放入水中，测其2 min内跨越原平台的次数及其在水迷宫外环停留时间。大鼠在相同时间内跨越原平台的次数越多，学习记忆能力越强，反之则越差。由配套电脑系统自动记录成绩。

1.6 海马神经细胞凋亡检测到达电针治疗结束后的预定时间，将大鼠麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)后，进行4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH值7.4)灌注固定：暴露心脏后升主动脉插管，先用100 ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛灌注固定后取海马脑组织。行石蜡包埋切片，按照武汉博士德公司提供的凋亡检测试剂盒说明书的操作步骤，用TUNEL染色技术进行海马神经细胞凋亡检测。结果判断：光镜下海马神经细胞核呈棕色着色者为阳性细胞，用JD801形态学显微图像分析系统进行分析，计算其积分光密度。

1.7 海马Syp免疫组化染色观察石蜡包埋切片，按照SABC免疫组化试剂盒说明书的操作步骤，用SABC免疫组化染色技术进行海马Syp免疫组化染色观察。结果判断：光镜下海马神经细胞上呈棕色着色者为阳性细胞，用JD801形态学显微图像分析系统进行分析，计算其积分光密度。

1.8 统计学方法采用SPSS13.0进行单因素方差分析及LSD检验。

2结果

2.1 电针对大鼠空间学习记忆的影响与假手术组比较，模型组大鼠平均逃避潜伏期明显长于假手术组，而与模型组比较，电针组大鼠平均逃避潜伏期明显短于模型组(P<0.01)。空间探索试验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠在平台象限跨越次数明显少于假手术组，而与模型组比较，电针组大鼠在平台象限跨越次数明显多于模型组(P<0.01)，提示模型组大鼠学习记忆能力较假手术组明显降低，而给予电针干预后则可改善治疗组大鼠的学习记忆能力。见表1。

2.2 电针对大鼠海马Syp表达的影响假手术组大鼠海马组织可见一定量的Syp阳性细胞，主要分布海马神经细胞上；模型组大鼠脑组织Syp免疫染色阳性细胞较假手术组明显增多，其免疫染色阳性细胞积分光密度值差异有统计学意义(P<0.05)；应用电针治疗后，大鼠脑组织Syp免疫染色阳性细胞数量较模型组比较有明显增加，其免疫染色阳性细胞积分光密度值与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，提示电针治疗后则可促进VD大鼠海马Syp的表达。

2.3 电针对大鼠海马神经元凋亡的影响假手术组海马细胞见及少数TUNEL染色阳性细胞，与假手术组比较，模型组海马见明显增多的TUNEL染色阳性细胞，其免疫染色阳性细胞积分光密度值差异有统计学意义(P<0.05)。经电针治疗后，与模型组比较，电针治疗组海马TUNEL染色阳性细胞数明显减少，其免疫染色阳性细胞积分光密度值差异有统计学意义(P<0.05)，提示电针治疗后则可抑制VD大鼠海马神经细胞的凋亡。见表2。

表1　各组水迷宫学习记忆行为学检测结果 ± s, n=10)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

表2　电针对大鼠脑海马组织Syp表达和

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3讨论

本实验结果表明在降低血压的同时采用重复脑缺血再灌注制备的动物模型出现了学习记忆功能障碍，模型成功模拟了人VD的临床表现，是较理想的VD动物模。突触数量和结构的变化均可影响神经突触可塑性，从而影响脑的神经冲动的传递和学习记忆功能。Syp是突触囊泡的一种特异标志性蛋白，它与突触结构和功能密切相关，其数量和分布密度可间接反映突触的密度〔8〕。近年来研究发现，当机体大脑出现缺血缺氧时，神经突触可代偿性增多，Syp表达也增加〔9～11〕。本实验结果提示脑缺血再灌注后，神经突触可代偿性增多。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡的过程,脑缺血再灌注可导致脑神经细胞凋亡〔1,2〕,本实验中神经细胞凋亡检测的TUNEL染色结果，验证了脑缺血再灌注可导致脑神经细胞凋亡，TUNEL染色结果。脑缺血时，神经细胞存活的数量和突触可塑性与脑学习记忆功能密切相关，结合本实验结果，认为电针大鼠百会、大椎穴改善VD大鼠学习记忆能力的机制可能与其抑制海马神经细胞凋亡和促进海马神经Syp表达有关。

4参考文献

1Zhang LM,Jiang CX,Liu DW. Hydrogen sulfide attenuates neuronal injury induced by vascular dementia via inhibiting apoptosis in rats〔J〕.Neurochem Res,2009;34(11):1984-92.

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3韦登明,贾学敏,尹向旭,等.电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞谷氨酸、NMDAR表达的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(19):3738-41.

4韦登明,贾学敏,尹向旭,等.电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞蛋白激酶C表达的关系〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(2):328-30.

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9 Ishimaru H，Casamenti F，Ueda K，etal．Changes in presynaptic proteins，SNAP-25 and synaptophysin，in the hippocampal CAI area in isehemie gerbils〔J〕．Brain Res，2001; 903(1)：94-101．

10Angers A，Fioravante D，Chin J，etal．Serotonin stimulates phosphorylation of Aplysia synapsin and alters its subeelular distribution in sensory neurons〔J〕．Neurosci，2002;22(13)：5412-22．

11王守春，吴江，孙莉，等．慢性脑缺血大鼠海马区和齿状回突触素表达变化与其认知功能关系的研究〔J〕．现代神经疾病杂志，2003;3(1)：142-5．

〔2014-01-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)