树莓中超氧化物歧化酶（SOD）提取及不同条件下酶活力探究

张媛婷，迟晓平，李婧萱，李剑华，李申岩

沈阳师范大学

树莓中超氧化物歧化酶（SOD）提取及不同条件下酶活力探究

张媛婷，迟晓平，李婧萱，李剑华，李申岩

沈阳师范大学

由冷冻树莓制得粗酶液，测树莓中超氧化物歧化酶（SOD）的活力48.78U/g，其含量228.544μg/g鲜重。通过分别以新鲜的树莓、解冻1h树莓和加入浓度为10-6mol/L的抗坏血酸浸泡1min的树莓果实来探究酶活力。结果表明：相对条件下，冷冻树莓有最大的超氧化物歧化酶（SOD）活力。

树莓；超氧化物歧化酶；提取；酶活力

引言：

树莓超氧化物歧化酶（SOD）是一种含有金属元素的活性蛋白酶存在于生物体内，是生物体内自然存在超氧自由基清除因子。

树莓产量较大，富含SOD和花青素等多种物质，能发展成果汁、化妆品生产线。因SOD具有强氧化力、抗衰老作用，在化妆品行业中应用广泛，但国际禁止在动物的血液中提取，故从多种植物中SOD，本次实验将从树莓果实中提取粗酶液并对SOD的活力进行探究。

正文：

1 材料与方法

1.1 材料

基础材料：丹东凤城树莓生产基地提供的树莓果实

1.2 试剂与仪器：

蛋氨酸(Met)，氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，核黄素，干燥的牛血清白蛋白，考马斯亮蓝，石英砂（SiO2），乙二胺四乙酸二钠，甲硫氨酸：辽宁永强医药器械化玻有限公司试剂厂；药品均为分析纯。

WFJ7200型可见分光光度计，Himac cR21G高速冷冻离心机，Sartrius分析天平。

1.3 提取方法

1.3.1 溶液的配制

溶液浓度：蛋氨酸磷酸钠缓冲液(蛋氨酸浓度2.6x10-2mol∕L，用0.1mol∕L磷酸钠缓冲液配制)；磷酸盐缓冲液0.05mol∕L(PH=7.8)；氮蓝四唑溶液750μmol∕L；核黄素溶液20μmol∕L；甲硫氨酸溶液130mmol∕L；乙二胺四乙酸二钠溶液100μmol∕L。

1.3.2 提取树莓液

冷冻研钵和研杵10min，冷藏磷酸缓冲溶液50mL，精确称取20g冷冻树莓果实于研钵中，加入磷酸缓冲液15mL和少许石英砂（SiO2）充分研磨后装入1.5mL离心管中，用高速冷冻离心机在12000r∕min，4℃条件下离心40min。离心后将上清液倒入量筒中，其中的沉淀重新在加入15mL磷酸缓冲溶液冷冻研钵中充分研磨，再装入离心管中离心40min。同样离心后将上清液倒入量筒中，合并两次上清液，即得粗酶液总体积。

1.4 NBT光还原法测酶活力

1.4.1 酶活力测定

取8支试管编号1-8，分别加入甲硫氨酸、氮蓝四唑、EDTANa2、核黄素、蒸馏水各1.00mL，依次加入缓冲液5.00、5.00、5.00、4.85、4.70、4.55、4.40、4.25 mL，粗酶液0.00、0.00、0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，混合均匀。标号为1号为空白组吸光度值归零，不光照，其余在两个210W大灯泡下照射15min。第2～8组在560nm下测吸光度值。

D1——第2组与第3组吸光度值平均值

D2——第4组到第8组各自的吸光度值

以下式求得20g冷冻树莓的总酶活力。

1.4.2 酶活力探究

按照1.3提取方法，分别用新鲜树莓，解冻1h树莓，浸泡在10-6mol∕L抗坏血酸溶液中1min的树莓果实代替冷冻树莓。得到各自粗酶液，以1.4.1测酶活力原理，得各自总酶活力来断定何种材料具有最大的超氧化物歧化酶（SOD）活力。

1.5 蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝法

1.5.1 蛋白质标准曲线的制作

准确称取己干燥的牛血清白蛋白0.01g溶解并定容100mL得标准蛋白溶液，取6支试管编号1-6，分别加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，依次加入标准蛋白液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，蒸馏水1.00、0.98、0.96、0.94、0.92、0.90 mL，以1号为空白组，在波长595nm条件下测定吸光度值，绘制曲线。

1.5.2 测定酶液的SOD含量

另取2支试管，均吸取在50%抑制率下的粗酶液量即XmL，移入试管中，依次加入(1-X)ml蒸馏水，5mL的考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀后静置2min，在OD595nm条件下，以标准曲线1号试管做空白，测吸光度值，并求两组吸光度平均值，再通过标准蛋白质曲线，得在X(mL)下SOD含量Y（μg）。根据下式可得总SOD含量。

2 实验数据处理

2.1 蛋白质标准曲线，图一