GRIM-19蛋白在taurolidine诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用

GRIM-19蛋白在taurolidine诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用

孙宝胜孟凡旭于士龙郎志国孙世龙1刘林林2刘士新

(吉林省肿瘤医院，吉林长春130000)

摘要〔〕目的探讨GRIM-19蛋白在taurolidine诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡中的作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同剂量组宫颈癌细胞(Hela细胞系)存活率的影响；采用流式细胞术检测不同剂量组Hela细胞的凋亡数据；采用Western印迹法检测各实验组中Hela细胞中GRIM-19蛋白的表达变化；同时采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测半胱氨酸蛋白酶(caspase)9的活性。结果MTT结果显示，taurolidine对Hela细胞生长有显著的抑制作用，流式细胞术结果显示出实验组Hela细胞凋亡比例显著上升，并呈现出明显的时程和量效关系(P<0.05)。Western印迹分析显示，与对照组相比，GRIM-19蛋白在各实验组Hela细胞中的表达显著提高(P<0.05)，同样显示出了一定的时程和量效关系。ELISA检测结果显示，caspase-9在各实验组Hela细胞中的表达显著增加，与GRIM-19蛋白的表达显示出了相当的一致性。结论Taurolidine可通过促进GRIM-19蛋白的表达诱导Hela细胞的凋亡，且线粒体凋亡很可能是taurolidine诱导Hela细胞凋亡的重要途径。

关键词〔〕宫颈肿瘤；基因表达；细胞凋亡；Taurolidine；GRIM-19

中图分类号〔〕R730.53〔

基金项目：吉林省发改委资助项目(No.2013C033)

通讯作者：刘士新(1964-)，男，教授，主要从事肿瘤放射治疗研究。

1吉林大学公共卫生学院2吉林大学第二临床医院

第一作者：孙宝胜(1972-)，男，副主任医师，主要从事妇科肿瘤放射治疗研究。

最近研究发现，taurolidine具有明显的抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的作用〔1～4〕。然而，taurolidine在不同的肿瘤细胞中，诱导凋亡的分子生物学机制不同。有研究报道，taurolidine通过提高线粒体中细胞色素c等凋亡因子的表达，激活半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)和caspase-3，诱导前列腺癌细胞凋亡〔5〕；也有文献报道，taurolidine通过激活线粒体途径诱导凋亡的同时，还通过激活Fas-liand，启动死亡受体途径，诱导脑神经胶质癌细胞凋亡〔2〕。GRIMs是Kalvakolanu等发现的一群参与干扰素(IFN)/维甲酸(RA)联合诱导细胞凋亡的基因。Seo等〔6〕发现，GRIM-19与病毒感染密切相关，指出乳头瘤病毒(HPV)-E6可与GRIM-19直接结合，诱导对宫颈癌及其癌前病变的发生。本研究旨在观察taurolidine对人宫颈癌Hela细胞是否具有诱导凋亡的特性，以及诱导凋亡的分子生物学机制。

1材料与方法

1.1试剂细胞培养液、小牛血清、青链霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸盐缓冲液(PBS)均购买于Invitrogen公司(Paisley，Scotland，UK)。taurolidine(Taurolin)溶剂由Geistlich Pharm AG(Wolhusen，Switzerland)赠送。除了在文章中具体指出，所有其他的化学试剂均购买于Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)。

1.2细胞及培养人宫颈癌Hela细胞购买于美国细胞库(Manassas，VA)。Hela细胞均在含有10%小牛血清、青霉素(100 U/ml)和谷氨酰胺(2 mmol/L)的DMEM培养液培养，并在37℃、5% CO2孵箱中贴壁生长。

1.3细胞存活实验待Hela细胞生长为指数期，调细胞浓度为1×105/ml。将Hela细胞种植在96孔培养板(100 μl/well)中，24 h后，分别给予不同浓度的taurolidine(0，10，25，50，100，200 μmol/L)。肿瘤细胞在37℃，CO2孵箱中培养24 h和48 h后，给予100 μl噻唑蓝(MTT，5.0 mg/ml)。3 h后，吸去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min在酶联免疫吸附仪上测量各孔光吸收值(CPM)。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组CPM值/对照组CPM值)×100%。

1.4细胞凋亡的检测待Hela细胞接近对数生长期，常规消化细胞，制成2.5×105细胞悬液，接种于6孔培养板中。24 h 后，分别给予不同浓度的taurolidine，并确定最终药物浓度分别为0，10，25，50，100，200 μmol/L。Hela细胞在37℃，CO2孵箱中继续培养24 h和48 h，将贴壁及悬浮的细胞离心，收集后震荡、混匀在碘化丙啶(PI)混合溶液中(50 μg/ml propidium iodide、3.4 mmol/L sodium citrate、1.0 mmol/L Tris、0.1 mmol/L EDTA、0.1% Triton X-100)，并在4℃环境中避光培养4～6 h。流式细胞仪(BD biosciences，Mountain View，CA)进行检测，Cell Guest软件(BD Biosciences)收集并分析结果。

1.5GRIM-19蛋白表达变化的检测待Hela细胞生长为指数期，将5×106细胞悬液种植在25 cm2培养瓶中贴壁、过夜后，用含有taurolidine的培养液调为理想的药物浓度和作用时间。用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗上述细胞3次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体。在培养皿中加入200 μl细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min后，通过Lowry method进行总蛋白定量分析。将样品上清液分装，-20℃保存。制备12%分离胶、5%积层胶。按计算好的样品量上样，使各组上样量相等，在8 V/era电压条件下开始进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到15 V/era，继续电泳直至溴酚蓝到达凝胶底部。电泳结束后，将SDS聚丙烯酰胺分离出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(Millipore，Bedford，MA，USA)。用含有5 %脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TrBS)(150 mmol/L NaCl、Tris、0.1% Tween20，pH 7.5)对上述硝酸纤维素滤膜进行封闭2 h，一抗GRIM-19(cell signal)室温孵育2 h，相应的二抗室温孵育1.5 h，增强化学发光法(ECL)试剂盒显色(Perkin Elmer)，拍照。

1.6caspase-9活性的检测caspase-9的活性由ApoTarget 试剂盒(BioSource International Inc，CA)检测。Hela细胞(5×106)接种于25 cm2培养瓶中贴壁；过夜后，给予含有taurolidine的培养液，并调定taurolidine药物终浓度为0、25、50和100 μmol/L。37℃、CO2孵箱中培养24 h后，提取细胞总蛋白，并进行定量分析。将100 μg蛋白同200 μmol/L底物混匀，在37℃、CO2孵箱中培养3 h之后通过酶标仪检测其吸光度值A值，490 nm。

2结果

2.1Taurolidine对Hela细胞存活率的影响当50 μmol/L的taurolidine作用于Hela细胞48 h时，导致了58%的细胞坏死，并显示明显的时效和量效关系。见表1。

2.2Taurolidine对Hela细胞凋亡的影响对照组的Hela细胞在培养48 h后，仅仅产生了<5%的细胞凋亡，当50 μmol/L的taurolidine作用于Hela细胞48 h后，可导致8.97 %的细胞凋亡，100 μmol/L的taurolidine作用于Hela细胞48 h后，可导致22.37 %的细胞凋亡，显示了明显的时效和量效的关系。见表2。

表1　不同浓度taurolidine作用于Hela细胞24 h和

表2　不同浓度taurolidine作用于Hela细胞24 h和48 h

2.3Western印迹法检测GRIM-19蛋白的表达变化由于taurolidine(50 μmol/L)在24 h能够显著的诱导Hela细胞凋亡，所以选择50 μmol/L的taurolidine作用于Hela细胞0、3、6、12和24 h后，观察其对GRIM-19蛋白的影响，结果显示：taurolidine能明显促进GRIM-19蛋白的表达，并具有明显的时效关系。见图1。

图1　Taurolidine作用于Hela细胞在不同时间点对 GRIM-19表达的影响

2.4caspase-9活性的测定0、25、50和100 μmol/L的taurolidine作用于Hela细胞24 h后，caspase-9活性(A490 nm)分别为0.05、0.15、0.30和0.50，结果显示了明显的剂量依赖效应。

3讨论

近几年许多文献报道，taurolidine可诱导多种肿瘤细胞凋亡，并且在体内动物实验中证实其抑制肿瘤局部生长及远距离转移作用〔1，3，4〕。本实验结果显示，taurolidine具有明显的诱导Hela细胞凋亡以及抑制细胞生长的特性，并且显示了明显的时间与量效依赖关系。

高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的主要病因，有研究发现，GRIM-19与病毒感染密切相关，指出HPV-E6可与GRIM-19直接结合，且高危型HPV的结合作用强于低危型，GRIM-19可能对宫颈癌的治疗和预后有提示作用〔6〕。Chidambaram等〔7〕研究表明，GRIM-19基因在人体多种正常组织中可被检测，参与IFN/RA诱导的肿瘤细胞凋亡。周颖等〔8〕采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染到宫颈癌Hela细胞，发现GRIM-19基因在宫颈癌Hela/GRIM-19细胞中表达显著升高，抑制细胞增殖，使肿瘤生长速度减慢，在一定程度上控制肿瘤细胞的恶性生物学行为〔8〕。

综上所述，本实验结果为taurolidine诱导肿瘤细胞凋亡的信号传导提供理论依据，并且为在体内观察该化学药物的抗肿瘤作用提供理论支持。

4参考文献

1McCourt M，Wang JH，Sookhai S.Taurolidine inhibits tumor cell growth in vitro and in vivo〔J〕.Ann Surg Oncol，2000；7(9)：685-791.

2Stendel R，Scheurer L，Stoltenburg-Didinger G，etal.Enhancement of Fas-ligand-mediated programmed cell death by taurolidine〔J〕.Anticanser Res，2003；23(3B)：2309-14.

3Calabresi P，Goulette FA，Darnowski JW.Taurolidine：cytotoxic and mechanistic evaluation of a novel antineoplastic agent〔J〕.Cancer Res，2001；61(18)：6816-21.

4Shrayer DP，Lukoff H，King T，etal.The effect of taurolidine on adherent and floating subpopulations of melanoma cells〔J〕.Anticancer Drugs，2003；14(4)：295-303.

5Darnowski JW，Goulette FA，Cousens LP，etal.Mechanistic and antineoplastic evaluation of taurolidine in the DU145 model of human prostate cancer〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2004；54(3)：249-58.

6Seo T，Lee D，Shim YS，etal.Viral interferon regulatory factor 1 of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus interacts with a cell death regulator，GRIM-19，and inhibits interferon/retinoic acid-induced cell death〔J〕.J Virol，2002；76(17)：8797-807.

7Chidambaram NV，Angelle JE，Ling W，etal.Chromosomal localization of human GRIM-19，a novel IFN-β and retinoic acid-activated regulator of cell death〔J〕.J Interferon Cytokine Res，2000；20(7)：661-5.

8周颖，卫莹，李敏，等.GRIM-19表达对子宫颈癌Hela细胞增殖的影响〔J〕.肿瘤，2009；29(10)：940-3.

〔2013-06-17修回〕

(编辑袁左鸣)