铁皮石斛组培快繁及移栽技术研究

林秀莲 ，钟均宏 ，杨自轩 ，严旭超 ，林永庚 ，钟春水 ，赖钟雄

（1.惠州工程技术学校，广东惠州516023；2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wal1．Ex Lind1．）为兰科石斛属多年生附生型草本植物，别名铁皮兰，因其茎节处呈黑褐色，又名黑节草。铁皮石斛是我国传统的名贵中草药，其化学成分为石斛多糖（高达21.7%）及石斛碱[1]。《中国药典》收录3种石斛属植物，铁皮石斛是之中最珍贵品种，具有滋阴清热、养胃生津、润肺止咳等功效，其所含的多糖成分具有增强人体免疫功能、防癌抗癌、恢复嗓音等功效[2]。铁皮石斛喜阴凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树干和岩石缝隙中。铁皮石斛的种子极为细小，胚胎发育不完全，缺乏胚乳组织，萌发率极低（不足5%）[3]，且自然条件下必须与兰菌共生才能萌发。因此无法在大田或苗床上播种，很难生产足够的实生苗用于栽培。与此同时，铁皮石斛对生长环境要求苛刻，成苗更困难。传统的人工繁殖方式如分株、扦插等，繁殖速度慢，增殖率很低。铁皮石斛具有极高的药用价值和经济价值，长期依赖采挖野生资源来满足市场需求。由于无节制的采挖以及铁皮石斛自身生长、繁殖特性和对生长环境的特殊要求等原因，导致其野生资源日益稀少，种源已临枯竭[4-11]。目前铁皮石斛工厂化育苗存在问题，组培技术有待于进一步优化，组培苗移栽和栽培方面的研究报道较少。利用组培快繁技术繁殖试管苗，不仅是解决铁皮石斛野生资源紧缺的有效方法，也对该物种的种质资源保护起到积极作用。该试验以市面上较少见诱导成功的红杆铁皮石斛原球茎为外植体，对原球茎增殖、原球茎分化、壮苗生根、试管苗驯化时间以及栽培基质等整个过程进行系统研究，并通过不同试验筛选出适合各个阶段的培养基配方或方法，以期缩短铁皮石斛组培苗生长周期、降低组织培养成本、提高其移栽成活率，为铁皮石斛工厂化育苗及其高效栽培提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛取自惠州工程技术学校园艺中心花卉大棚。9月授粉成功后，来年2月选择天气晴朗的下午采收种子，将其接种在MS培养基上诱导原球茎，以诱导的原球茎进行以下试验。

1.2 方法

1.2.1 原球茎增殖。将原球茎分别接种在以下培养基中：I-1：MS+20 g/L 蔗糖+6 g/L 琼脂；I-2；MS+10%马铃薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；I-3：MS+20%马铃薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；I-4：MS+30%马铃薯泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；I-5：MS+20%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂；I-6：MS+10%马铃薯泥+20%香蕉泥＋20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。每个处理20瓶，每瓶接种3团相似大小原球茎，每7 d观察记录1次，40 d后统计增殖率：增殖系数（%）=40 d后原球茎团数／接种数×100。

1.2.2 原球茎分化。在MS+0.5 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+200 ml/L椰汁的培养基上，分别添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L BA，比较不同浓度 BA对原球茎分化的影响。培养基代号分别为II-1～II-6。每个处理20瓶，每瓶接2团，每7 d观察记录1次，40 d后统计分化系数。分化率（%）=植株分化总数/接种总数×100。

1.2.3 壮苗生根培养。在0.5 mg/L NAA+15%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的基础上，比较MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4种基本培养基对铁皮石斛壮苗生根的影响。选取2 cm以上，有3片完整叶片的无根苗转入生根培养基中培养生根。每个处理30瓶，每瓶接种3株，每7 d观察记录1次，40 d后统计生根率。

以上培养基 pH 均为 5.8，并在 1.1 kg·cm2、121 ℃下消毒20 min。

1.2.4 炼苗驯化时间的确定。将具有3～4片叶的铁皮石斛生根苗进行大棚驯化炼苗 7、14、21、28 d，以松树皮为基质，每个处理设90株生根组培苗，设3次重复，移栽45 d后记录小苗长势情况。

1.2.5 栽培基质的选择。将驯化28 d后的铁皮石斛分别移栽在以下基质中：①松树皮；②松树皮∶椰糠=1∶1；③松树皮∶椰糠∶石头=1∶1∶1，比较不同基质对移栽成活率及长势的影响。以上3种基质，每个处理500株丛苗，设3次重复，移栽60 d后统计成活率及小苗长势。

1.3 培养条件

培养室温度（25±2）℃，生根培养光照 3 000 lx，其他为暗培养，湿度保持在70%。大棚温度在（25±5）℃，光照 10 000 lx，湿度保持在 70%。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对原球茎增殖的影响

铁皮石斛种子在MS空白培养基上进行播种，3～4个月后可陆续长出原球茎。以这些原球茎为材料，研究不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖的影响，结果见表1。根据方差分析结果，不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖有显著影响。根据6个处理的均值与两两比较结果，处理I-6的增殖系数最大且与其他5个处理均存在显著差异；此外，I-6处理的原球茎簇生、松散并呈深绿色（图1-A）。因此，同时添加10%马铃薯泥与20%香蕉泥对铁皮石斛原球茎增殖效果最好，系数为3.05。

2.2 不同BA浓度对原球茎分化的影响

在MS+0.5 mg/LNAA+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+200 ml/L椰汁的培养基上，研究不同BA浓度对铁皮石斛原球茎分化的影响，结果见表2。根据方差分析结果，不同浓度BA对铁皮石斛原球茎分化有显著影响。根据6个处理的均值与两两比较结果，处理II-6的分化率最高，其次是II-5，这2个处理与其他4个处理均存在显著差异。此外，II-5与II-6处理的原球茎分化整齐健壮，但II-6处理的分化率最高（图1-B）。因此，添加3.0 mg/L BA对铁皮石斛原球茎分化效果最好，分化率为97%。

表1 不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖的影响

表2 不同BA浓度对铁皮石斛原球茎分化的影响

2.3 不同基本培养基对壮苗生根的影响

在0.5 mg/L NAA+15%香蕉泥+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂的基础上，比较 MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4 种基本培养基对铁皮石斛壮苗生根的影响，结果见表3。根据方差分析结果，不同基本培养基对铁皮石斛壮苗生根有显著影响。根据4个处理的均值与两两比较结果，1/2MS作为基本培养基的处理生根率最高，处理的原球茎分化苗健壮，且与其他3个处理均存在显著差异。因此，1/2MS作为基本培养基对铁皮石斛壮苗生根效果最好，生根率为99%（图1-C）。

2.4 驯化时间对组培苗移栽成活率的影响

将具有3～4片叶的铁皮石斛生根苗进行大棚驯化 7、14、21、28 d，以松树皮为基质，结果见表 4。根据方差分析结果，不同驯化时间对铁皮石斛组培苗移栽成活有显著影响。根据4个处理的均值与两两比较结果，驯化28 d的处理移栽成活率最高，处理的组培苗健壮，且与其他3个处理均存在显著差异。因此，驯化28 d对铁皮石斛组培苗移栽成活效果最好（图1-D），成活率为96%。

表3 不同基本培养基对铁皮石斛壮苗生根的影响

表4 不同驯化时间对铁皮石斛成活率的影响

2.5 栽培基质对组培苗生长的影响

将驯化28 d后的铁皮石斛分别移栽在不同基质中，比较不同基质对移栽成活率及长势的影响，结果见表5。根据方差分析结果，不同栽培基质对铁皮石斛组培苗成活率及壮苗指数有极显著影响。根据3个处理的均值与两两比较结果，单独添加松树皮或者添加松树皮、椰糠、石头的混合基质处理移栽成活率都较高，且2个处理的壮苗指数较高，与以松树皮∶椰糠为基质的组培苗相比，有显著差异。在研究中，发现同时添加松树皮、椰糠与石头的栽培基质，铁皮石斛组培苗更加壮硕，苗也更高（图2），这可能与铁皮石斛好气性相关。因此，适合铁皮石斛移栽的基质为松树皮∶椰糠∶石头=1∶1∶1。

3 讨论

通过试验研究，获得了通过原球茎增殖、分化、壮苗生根等方法得到的铁皮石斛再生植株。但这种通过播种形成原球茎的方式只是组织培养获得再生植株的一种方法。在今后的试验中，可尝试通过选择其他适宜的外植体获得完整植株以解决铁皮石斛资源紧缺的问题。

表5 不同栽培基质对铁皮石斛组培苗生长的影响

图1 铁皮石斛的组培快繁技术

图2 移栽5个月的铁皮石斛大棚移栽苗

组培苗在无菌、有营养供给、适宜光照和温度、100%相对湿度环境中生长[12-18]，但在驯化移栽过程中，环境发生了剧烈变化，如果不能谨慎处理好与环境因子的关系，就有可能造成大量死苗，进而影响整体经济效益。铁皮石斛喜温暖、湿润、半阴的气候环境，该试验研究了驯化时间与栽培基质对铁皮石斛成活率的影响，但其成活率还有待提高。因此，选择适宜的驯化时间，并筛选出适宜的移栽基质，结合调节环境条件，特别是移栽前期的湿度与温度控制是提高移栽成活率的重要环节，也是今后要研究的重要内容。

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