半乳凝素-3和5-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义*

曹 维，周国雄，张海峰，丁晓凌

（南通大学附属医院消化内科，江苏226001）

·论著与基础研究·

半乳凝素-3和5-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义*

曹 维**，周国雄，张海峰，丁晓凌

（南通大学附属医院消化内科，江苏226001）

目的：研究半乳凝素3（galectins-3，Gal-3）和5脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）在胰腺癌中的表达及其关系。方法：收集胰腺癌44例组织及其配对的癌旁组织，采用RT-PCR检测Gal-3和5-LOX的mRNA表达情况；采用免疫组织化学染色法检测Gal-3和5-LOX的蛋白表达及分布。结果：Gal-3和5-LOX在胰腺癌组织中的mRNA表达分别为40例（90.9%）和38例（86.4%），均明显高于配对的癌旁组织5例（11.4%）和7例（15.9%），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴结转移和病理分期Ⅱ期胰腺癌组织中Gal-3和5-LOX的阳性表达率高于无淋巴结转移和病理分期Ⅰ期（P＜0.05），且Gal-3和5-LOX mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和血管侵犯无显著相关。Gal-3和5-LOX有协同作用，呈高度正相关（r=0.71，P＜0.05）。Gal-3在胰腺癌组织和癌旁组织中蛋白阳性表达，分别为39例（84.1%）和8例（13.6%），两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05），且多为强阳性表达。5-LOX在胰腺癌组织和癌旁组织中的蛋白阳性表达，分别为37例（84.1%）和8例（18.2%），两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05），且多为阳性表达。方法：Gal-3和5-LOX在胰腺癌中表达增高，与病理分期和淋巴结转移有关，Gal-3和5-LOX表达呈正相关。

胰腺癌；半乳凝素3；5脂氧合酶；免疫组织化学染色法；逆转录聚合酶链反应

胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤，近20年来其患病率和病死率逐渐上升，5年生存率＜4%。由于胰腺癌早期不易被发现，手术切除仍然是唯一有效的治疗手段，但胰腺癌的切除率仅在20%左右，且手术切除后的中位生存时间也仅20个月[1]。因此深入研究胰腺癌的发病机制对探索更为有效的预防和早期诊断具有重要意义。近年来研究表明，半乳凝素参与多种生理和病理过程[2]，也有研究报道5脂氧合酶（5-LOX）基因在胰腺癌中表达上调[3]。2006年1月—2014年8月，我院外科经手术切除病理证实胰腺癌44例，本文初步探讨Gal-3和5-LOX在胰腺癌组织中的表达及其两者相互关系，以期为胰腺癌的诊断和治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺癌44例及其配对癌旁组织，部分组织甲醛固定，另一部分组织置液氮罐冻存后转入-80℃冰箱保存。Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒和PCR master Mix扩增试剂盒（Fermentas公司），鼠抗人Gal-3和兔抗人5-LOX（美国Santa Cruz公司），抗小鼠生物素化二抗和抗兔生物素化二抗（上海明睿生物技术有限公司）。PCR引物采用Premier 5.0软件设计，由Invitrogen（上海）公司合成。Gal-3引物序列为5'-GGCCACTGATTGTGCCTTAT-3'和5'-CAAATGGG

AAAACCGACTGT-3'，产物243 bp；5-LOX引物序列为5'-TCATCGTGGACTTTGAGCTG-3'和5'-AGAAGGTGGGTGATGGTCTG-3'，产物262bp；内参β-actin引物序列为5'-AAGTACTCCGTGTGGATCG G-3'和5'-ATGCATTCACCTCCCCTGTG-3'，产物486 bp。

1.2 方法 （1）RNA提取及RT-PCR：将胰腺癌组织及其癌旁组织用玻璃研磨器充分研磨，采用Trizol一步法提取总RNA。测其浓度和纯度，用反转录试剂盒（Fermentas公司）进行逆转录合成cDNA，采用β-actin为内参。用PCR扩增试剂盒（Fermentas公司）扩增，PCR反应参数：94℃3 min、94℃30 s、55℃40 s、72℃40 s，30次循环，72℃10 min.PCR产物经电泳分离后用图像扫描仪测定光吸收值，以目的条带与β-actin条带的光吸收值比为mRNA相对表达量。（2）免疫组织化学染色法检测蛋白的表达和分布：固定组织经石蜡包埋、切片，行常规免疫组化染色。Gal-3和5-LOX一抗及二抗工作浓度按1:100稀释，最后DAB显色、苏木精复染，盐酸酒精分化；脱水、透明、封片、镜检。阴性对照采用PBS液体替代一抗，其他步骤同前。镜下观察肿瘤细胞胞浆内及胞膜出现棕黄色颗粒为表达阳性细胞，免疫组化评分方法（IHS评分法）[4]如下：按染色强度评分：无色为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，＞80%为4分。将二者相乘得综合免疫组化评分：0定为-，1～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件处理数据，计量数据用均数±标准差（x¯±s）表示，两组比较行t检验，多组比较行方差分析；计数资料用百分比表示，行χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Gal-3和5-LOX mRNA在胰腺癌中的表达及与癌旁组织的关系 胰腺癌44例组织中，扩增出243bp的Gal-3mRNA阳性表达40例（90.9%）高于癌旁组织中5例（11.4%），差异有统计学意义（χ2= 55.71，P＜0.05）。扩增262bp的5-LOX阳性表达38例（86.4%）高于癌旁组织7例（15.9%），差异有统计学意义（χ2=43.70，P＜0.05），见图1。

图1 Gal-3和5-LOX mRNA表达的变化

2.2 胰腺癌中Gal-3 mRNA和5-LOX mRNA的表达与胰腺癌临床病理特征关系及相互关系 Gal-3和5-LOX在性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和血管侵袭上的表达差异无统计学意义；Gal-3和5-LOX在病理分期和淋巴结转移上的表达差异有统计学意义（χ2=4.37和5.05，P＜0.05；χ2=4.60和5.44，P＜0.05）。说明Gal-3和5-LOX的表达与肿瘤的病理分期和淋巴结转移相关（表1）。

Gal-3 mRNA阳性40例中5-LOX mRNA阳性36例（90.0%），Gal-3 mRNA表达阴性4例中5-LOX mRNA阴性2例（50.0%）；Gal-3 mRNA和5-LOX mRNA两者呈正相关（r=0.71，P＜0.05）。

表1 Gal-3和5-LOX mRNA在胰腺癌中表达与临床病理参数关系 例

2.3 胰腺癌中Gal-3和5-LOX的蛋白表达及与癌旁组织关系 在胰腺癌组织中Gal-3蛋白阳性表达39例（88.6%），且多为强阳性表达，高于癌旁组织中的Gal-3的阳性表达6例（13.6%）。癌旁组织以不表达或弱表达为主，差异具有统计学意义（χ2=49.53，P＜0.05，图2，表2）。在胰腺癌组织中5-LOX的蛋白阳性表达37例（84.1%），多为中等或强阳性表达，高于癌旁组织中的5-LOX的阳性表达8例（18.2%），且在癌旁组织中以不表达或弱表达为主，差异具有统计学意义（χ2=38.25，P＜0.05，图3，表2）。

图2 Gal-3在胰腺癌和癌旁组织中的表达（免疫组化，200×）

图3 5-LOX在胰腺癌和癌旁组织中的表达（免疫组化，200×）

表2 Gal-3和5-LOX蛋白在胰腺癌及其癌旁组织中的表达情况 例

3 讨 论

凝集素（lectin）是自然界广泛存在的一类选择性识别糖结构并与其非共价结合的蛋白质，根据来源分为动物凝集素、植物凝集素和微生物凝集素。半乳凝素（Gal）是动物凝集素家族的一员，近年来其作用日渐受到重视。而Gal-3是Gal家族的一员，广泛表达于正常组织中如正常结肠粘膜、前列腺、肝、卵巢以及肿瘤组织如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌及膀胱癌等中[5-7]。在多数肿瘤中可呈高表达，发挥着多种生物学作用，包括调节细胞的生长、凋亡、细胞黏附及参与新生血管形成及肿瘤浸润与转移等[8-9]。Hancq等[10]分析良性脑膜瘤39例和非典型性脑膜瘤24例，发现后者的Gal-3表达率较前者明显增高，提示Gal-3在非典型性脑膜瘤的侵袭和病理分析方面发挥作用。Idikio等[7]研究发现，在正常乳腺组织中Gal-3也是高表达的，但在乳腺癌组织中Gal-3的表达量却出现下调现象，提示Gal-3在各肿瘤中的表达情况不一致。本实验中Gal-3 mRNA和蛋白表达在胰腺癌中高表达，与Berberat等[11]研究结果相一致，提示Gal-3可能成为胰腺癌的诊断标志物。

近年来国内外研究发现5-脂氧合酶（5-LOX）及代谢产物与肿瘤密切相关。以发现5-LOX在许多肿瘤组织中如肺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤和乳腺癌等细胞中都有过表达[12-15]，其过度表达促进细胞过度增殖和抑制凋亡是肿瘤发生发展的重要环节。Ding等[16]报道5-LOX在胰腺癌中表达，而在正常胰腺癌细胞中不表达。本研究中胰腺癌44例组织中，扩增出5-LOX条带38例（86.4%），免疫组化中5-LOX蛋白阳性表达率为84.1%，说明胰腺癌组织中5-LOX高表达，与文献报道一致。花生四烯酸可通过COX和LOX两条途径代谢，COX与LOX代谢产物间存在着一定平衡制约关系。其5-LOX抑制剂抑制肿瘤生长的作用比COX强，Funk等[17]报道敲除5-LOX基因的小鼠生长正常，繁衍小鼠无畸形，说明5-LOX对身体组织生长不是必需的。因此5-LOX基因在胰腺癌的预防和治疗方面将有广阔的前景，并且有研究报道Gal-3和花生四烯酸在神经炎和特征肝病中有一定的表达关系[18-19]。而5-LOX又是花生四烯酸中一条重要通路，Gal-3与花生四烯酸的作用是否通过5-LOX这一通路还有待进一步研究。

本实验检测了Gal-3和5-LOX基因和蛋白表达水平，发现两者在胰腺癌组织中均呈高表达状态，并与胰腺癌的病理分期和淋巴结转移有关，且相关分析结果显示两者之间呈现正相关。这些结果提示Gal-3和5-LOX在胰腺癌的发生发展过程中，可能通过相互协调作用，发挥其抗凋亡促进胰腺癌细胞的增殖，导致胰腺癌组织中的淋巴结转移。

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Expression of Gal-3 and 5-Lox in pancreatic cancer and its clinical significance

CAO Wei,ZHOU Guoxiong,ZHANG Haifeng,DING Xiaoling
(Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

Objective:To detect the expression of Gal-3 in pancreatic cancer and explore the relationship between the expression of Gal-3 and 5-LOX.Methods:The expression of Gal-3 and 5-LOX mRNA in 44 pancreatic cancer and paired adjacent tissues was assayed by real-time PCR.Immunohistochemistry was used to determine the expression and localization of Gal-3 and 5-LOX in 44 pancreatic cancer and paired adjacent tissues.Results:The positive rate of Gal-3 and 5-LOX mRNA expression in pancreatic cancer tissues were all higher than those in adjacent paired tissues(90.9%vs 11.4%and 86.4%vs 15.9%,P＜0.05).The positive rate of Gal-3 and 5-LOX mRNA expression in patients with lymph node metastasis and in TNM stageⅡwere significantly higher than those in patients without lymph node metastasis and in TNM stageⅠ (P＜0.05).Gal-3 and 5-LOX mRNA expression were not associated with gender,age,tumor location,tumor size,differentiation and vascular invasion (P＞0.05).There was a positive correlation between at Gal-3 and 5-LOX protein levels（r=0.71,P＜0.05）.The positive rates of Gal-3 protein expression in pancreatic cancer tissues were all higher than those in adjacent paired tissues（88.6%vs 13.6%,P＜0.05）;The positive rates of 5-LOX protein expression in pancreatic cancer tissues were all higher than those in adjacent paired tissues（84.1%vs18.2%,P＜0.05）.Conclusion:Gal-3 and 5-LOX expressions are up-regulated in pancreatic cancer,which is closely correlated with the pathological staging and lymph node metastasis.

pancreatic cancer;Gal-3;5-LOX;immunohistochemistry;reverse transcritate polymerase chain reaction

R735.9

A

2015-04-24

1006-2440（2015）03-0218-04

国家自然科学基金资助项目（81072028）；江苏省创新团队医学领军人才项目（LJ201135）。

**[作者简介]曹维，男，汉族，江苏南通人，生于1982年2月，硕士，主治医师。研究方向：胰腺肿瘤。 通信作者：周国雄，zhouguoxiong@medmail.com.cn