Twist1基因对膀胱癌上皮间质转化的影响*

王小林，曹广鑫，侯建全

（1南通市肿瘤医院泌尿外科，江苏226361；2苏州大学附属第一医院泌尿外科）

Twist1基因对膀胱癌上皮间质转化的影响*

王小林1**，曹广鑫1，侯建全2

（1南通市肿瘤医院泌尿外科，江苏226361；2苏州大学附属第一医院泌尿外科）

目的：探讨Twist1基因对膀胱癌上皮间质转化（EMT）过程的影响。方法：上调Twist1基因的表达，实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测膀胱癌细胞中EMT相关基因表达情况。结果：Twist1基因成功转染进膀胱癌T24细胞，转染Twist1的细胞中Twist1 mRNA表达量是转染空载细胞中的11 920倍。转染Twist1组表达量为空载组snail1 1.2倍，snail2 1.2倍，E-cadherin 0.8倍，Fibronectin 3.2倍，N-caderin 1.5倍和Vimentin mRNA 1.2倍。方法：Twist1在膀胱癌细胞EMT过程中起到一个正性调控作用，能够促进膀胱癌细胞EMT过程。

膀胱癌；Twist1基因；上皮间质转化；实时定量聚合酶链反应

2014年全美大约有74 690例新发膀胱癌患者，并有大约15 580例患者死于膀胱癌[1]。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）与膀胱癌的侵袭、转移密切相关，同时还与膀胱肿瘤分期、分级相关[2]。Twist1作为EMT中一个重要转化因子如何发挥作用，目前尚不十分清楚。本研究选取膀胱癌T24细胞作为研究对象，将Twist1转染进T24细胞，检测EMT相关基因（上皮细胞标记物如E-cadherin，间叶细胞标记物如fibronectin，vementin，N-cadherin）表达情况，以此了解膀胱癌中Twist1对EMT影响。

1 材料与方法

1.1 材料 pcDNA3.1-Twist1合成与载体构建均由invitrogen公司完成。细胞株：人膀胱癌细胞株T24（中科院上海细胞库）。主要试剂：培养液：RPMI1640（Hyclone，Cat.:SH30809.01B），10%FBS（Hyclone，Cat.:SV30087.02）。胰酶（GIBCO，Cat.：25200-072）；PBS（Hyclone，SH30256.01B）。质粒抽试剂盒：北京艾德莱，Cat.:PL08。转染试剂盒：Lonza，Cat: VCA-1001，RNA提取试剂盒：TaKaRa，Cat:9767反转录试剂盒：TaKaRa，Cat:RR037A，Power SYBR green PCR master mix（2×）：ABI，Cat:4367659。

1.2 方法

1.2.1 质粒扩增及抽提：含pcDNA3.1、pcDNA3.1-Twist1的菌液分别涂布于含氨苄青霉素（100μg/ mL）的LB平板上，第2天挑取单克隆于50mL含Amp的LB液体培养基中振摇过夜，收集菌体，按质粒抽试剂盒说明书抽提质粒，定量后保存于低温冰箱。

1.2.2 细胞培养及转染：T24细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，转染当天细胞状态良好。按转染试剂盒说明书进行操作，转染完成后分别接种于6孔板培养。

1.2.3 RNA提取反转录及qPCR分析：上述细胞培养48小时后，按RNA提取试剂盒提取RNA。定量后以 5×PrimerScript Buffer 2μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6 mers 0.5μL，Total RNA 400ng，RNase Free dH2O加至10μL配制RT反应液，放入PCR仪中。设定程序：37℃，15min→85℃，5s→4℃，反转结束后，定量并保存于4℃。

按 Power SYBR green PCR master mix（2×）15μL，Primer 0.6μL×2，cDNA10ng，ddH2O加至30μL配制qPCR反应液，引物序列见表1，设定反应程序：95℃，10min→95℃，15s；60℃，1min；40cycles→95，15s→60℃，1min→95，15s→60℃，15s。8种基因引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

采用2-△△CT法，以β-actin为内参，定量检测转染pcDNA3.1与转染pcDNA3.1-Twist1的T24细胞中 snail1，snail2，E-cadherin，Fibronectin,N-caderin和Vimentin mRNA的表达水平。结果表明，Twist1转染成功，转染Twist1的细胞中Twist1 mRNA表达量是转染空载细胞中的11 920倍。Twist1组中snail1，snail2，E-cadherin,Fibronectin,N-caderin和Vimentin mRNA的表达量分别是空载组的1.2倍，1.2倍，0.8倍，3.2倍，1.5倍和1.2倍，见表2。

表2 各基因表达情况

3 讨 论

在膀胱肿瘤的浸润转移过程中，涉及多种分子机制。近年来EMT在肿瘤转移方面的作用及相关机制的研究，逐渐受到大家的重视，成为有关肿瘤转移研究方面的热点之一[3]。在肿瘤浸润转移过程中EMT作用过程包括：原发肿瘤上皮细胞转化成获得间质表型的细胞，获得了运动的能力。脱离原发部位侵袭周围组织进入血液循环后，在远隔部位通过间质细胞上皮化（mesenchymal-epithelial transition，MET）形成新的转移灶[4-6]。若符合下述情况可判定细胞发生EMT：细胞由多角形上皮细胞形态转变成纺锤形的间质细胞形态，失去细胞极性；迁徙和侵袭的能力增加；抗凋亡的能力增加；诱导EMT的因素移除后仍然能够维持表型的稳定；一些上皮细胞标志物的丢失（E-cadherin），间叶细胞标记物的获得（fibronectin,vementin,N-cadherin）[7]。EMT与膀胱癌的侵袭、转移密切相关，同时还与膀胱肿瘤分期、分级相关[2，8]。

EMT主要受一组转录因子的控制，包括Zeb-1/ 2，Twist1，Snail和slug。这些因子使组蛋白去乙酰化并与E-cadherin启动子中的增强子结合，阻止E-cadherin基因的转录及表达[9]。Leptin研究证实在果蝇中胚叶形成过程Twist1通过直接诱导Snail家族中的Snail1表达导致EMT[10]。然而新近研究表明，在人乳腺癌细胞株和活体肿瘤模型中Snail2才是Twist1在抑制E-cadherin活性导致EMT的直接靶点，同时在Snail2缺失的情况下整个EMT进程将被终止[11]。在人膀胱癌细胞中，Twist1是如何发挥其作用，其与Snail家族间关系如何，值得进一步的研究去探索。

本研究发现，上调Twist1基因后，snail1，snail2基因的mRNA表达量呈上升趋势，表明在人膀胱癌细胞EMT过程中，Twist1与snail1，snail2呈现协调作用方式，但Twist1究竟是和snail1，snail2中的哪个共同发挥作用，还需要进一步的实验来验证。同时随着Twist1基因的上调，E-cadherin表达出现下降，E-cadherin作为EMT过程中的关键因子，显示出的结果与文献报道相符[12]，表明Twist1在膀胱癌中是通过E-cadherin最后发挥作用。本文还检测Fibronectin、N-caderin和Vimentin等间质标记物，其mRNA的表达量均出现不同程度的上升，说明在上调Twist1后，人膀胱癌细胞表现出EMT相应表象，进一步证实Twist1能够在膀胱癌细胞中促进EMT过程发生。

然而，我们发现经过转染pcDNA3.1-Twist1后的细胞，Twist1表达上升幅度与检测到相关基因的表达变化程度虽呈现出相关性，但欠缺说服力。在后续工作中，将进一步对于Twist1功能进行深入研究。

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Effect of Twist1 to Epithelial Mesenchymal Transition in Bladder Cancer

WANG Xiaolin1,CAO Guangxin1,HOU Jianquan2
（1Department of Urology,Nantong Tumor Hospital,Jiangsu 226361;2Department of Urology,the First Affiliated of Soochow University）

[Abstart] Objective：To investigate the effect of twist1 to epithelial mesenchymal transition(EMT)in bladder cancer.Methods：The Expression of Twist1 was upgraded,and the expressions of EMT markers in bladder cancer were detected by QPCR.Results：Twist1 was successfully transfected into T24,expressions of Twist1 mRNA were 11920 times as much as in the control.Snail1，snail2、E-cadherin、Fibronectin、N-caderin、Vimentin mRNA were 1.2、1.2、0.8、3.2、1.5、1.2 times as much as in the control respectively.Conclusions：Twist1 acts as a positive regulatory role to EMT in bladder cancer,and may promote EMT in bladder cancer.

bladder cancer;Twist1;epithelial mesenchymal transition;real time polymerase chain reaction

R737.14

A

2015-03-24

1006-2440（2015）03-0231-03

南通市人才工作专项资金（W201208）；南通市社会事业科技创新与示范计划（HS2013023）。

**[作者简介]王小林，男，汉族，江苏南通人，生于1978年11月，医学硕士，副主任医师。研究方向：泌尿系统肿瘤基础与临床研究。 通信作者：侯建全，E-mail：jianquanhou@163.com